摘要目的：探讨内源性血红素加氧酶（heme oxygenase, HO）/一氧化碳（carbon monoxide, CO）系统对大鼠主动脉球囊损伤后新生内膜形成及丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)激活的调节作用。方法：采用大鼠主动脉内膜球囊拉伤模型，观察HO抑制剂锌卟啉-9(zinc protoporphyrin IX, ZnPP-9)或其底物血红素-左旋-赖氨酸盐(heme-L-lysinate, HLL)对血管壁细胞³H-TdR掺入和MAPK活性的影响，同时观察血管平滑肌HO活性和CO生成的变化。结果：内膜拉伤后2周血管³H-TdR掺入和MAPK活性明显增加，同时HO活性和CO的产生增加；ZnPP-9使血管的³H-TdR掺入和MAPK活性增加更为明显(分别比单独拉伤组增加34.6%和39.2%,均为P＜0.01)；而HLL使血管的³H-TdR掺入和MAPK活性则明显降低(比单独拉伤组分别减少29.45%和33.6%,均为P＜0.01)。结论：HO活性上调或CO产生增加是血管对机械拉伤的一种保护性应激反应;内源性HO/CO系统直接参与新内膜形成中血管壁细胞的增殖调节，HO活性诱导有可能成为临床上防治血管增殖性疾病的一种新途径。

中国图书资料分类法分类号R654.3-332

The role of endogenous carbon monoxide on neointimal formation and mitogen-activated protein kinase activity in aortic artery of rats after balloon-injury

OU He-Sheng^＃, YAN Li-Mei, YANG Jun, WANG Pei-Yong, PANG Yong-Zheng, SU Jing-Yi, TANG Chao-Shu

(#Institute of Cardiovascular Disease, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing100034)

MeSHHeme oxygenase/pharmacolCarbon monoxide/pharmacolMitogen-activated protein kinase^☆Tunica intima/drug off

ABSTRACTObjective: The purpose of this study was to investigate the role of endogenous carbon monoxide (CO) on neointimal formation and mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity.Methods: On a rat model of aortic endothelium balloon-injury. Vascular³H-TdR incorporation, MAPK activity, heme oxygenase (HO) activity and CO release were measured after treatment of ZnPP-9, an HO inhibitor, or heme-L-lysinate (HLL), an HO substrate.Results: Vascular³H-TdR incorporation and MAPK activity were significantly increased on day 14 after endothelium balloon-injury while HO activity and CO release were up-regulated. The increased vascular³H-TdR incorporation and MAPK activity after balloon-injury could be enhanced by pretreatment of ZnPP-9, whereas they could be inhibited by pretreatment of HLL.Conclusion: HO activity up-regulation in aorta was a protective response to balloon-injury; endogenous HO/CO system is involved in the regulation of cell proliferation during neointimal formation , and HO induction may become a new clinical approach to prevent cell proliferation in some vascular disease.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:404-407)

再狭窄的主要病变是血管内膜受损部位出现内皮剥脱、内皮细胞再生、平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)增殖和迁移并形成新内膜。细胞增殖和迁移的机制有待阐明。内源性一氧化碳(carbon monoxide, CO)是由血红素在加氧酶(hemeoxygen-

ase, HO)作用下降解产生的小分子气体，新近发现内源性CO在心血管系统有重要的生理和病理调节作用^［1］。我们最近的工作表明，内源性HO/CO系统参与了血管内膜剥脱后血管壁增厚和新内膜形成^［2］。然而内源性CO对新内膜中细胞增殖有无影响，以及对丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号传递系统的影响，目前尚未见报道。本工作在大鼠主动脉内膜球囊剥脱模型上，观察血管³H-TdR掺入和MAPK活性改变以及与平滑肌HO活性和CO生成之间的相互关系，以探讨内源性HO/CO系统对血管壁细胞增殖及其MAPK活性调节的影响。

1材料与方法

大鼠主动脉内膜球囊剥脱术^［3］：选350～400g雄性Wistar大鼠(北京医科大学动物中心提供)随机分为4组：对照组、剥脱组、HO抑制组、HO底物组。对照组为10只，其余3组为8只。剥脱组大鼠分离左颈总动脉，将改良的Forgarty球囊导管(2F)经此插入腹主动脉，充盈球囊后反复抽拉3次以剥脱主动脉内膜。后两组分别在剥脱术前给予ZnPP-9和HLL (均为45 μmol·kg^－1.d^－1， ip)，1周后行剥脱术, 术后给药持续2周。对照组除不插入导管外，其余操作同剥脱组。

血管条³H-TdR掺入^［4］：动物术后14 d，摘取胸主动脉约1 cm纵行切开后，置于1.5 ml RPMI 1640培养液中，加入5.6×10⁴Bq的³H-TdR，在通气条件O₂与CO₂体积比为9∶1, 37 ℃的恒温水浴振荡器上孵育24 h，冷PBS冲洗3次，甲酸消化后用液闪仪测定其放射强度。

MAPK活性测定^［5］：将主动脉剪成碎块，加入冷提取液后匀浆，离心后取上清0.5 ml与5 μg特异性MAPK抗体于4℃共同孵育4 h,收集免疫复合物与预先吸附有抗鼠IgG的Agarose deads孵育30min,沉淀下的蛋白再加入溶解液0.5 ml混匀，取其中150 μl与20 μl激酶缓冲液在25℃孵育25 min,取100 μl点于P₈₁Phosphocellulose滤纸(Whatman)上，在液闪仪上测定髓磷脂碱性蛋白中³²P的掺入量，结果以每分每毫克蛋白掺入³²P的pmol数表示。

主动脉平滑肌HO活性和CO释放量测定：主动脉去掉内膜和外层组织，平滑肌层用于以下HO活性和HbCO形成的测定。

HO活性测定采用Morita等^［6］的方法稍加改良。主要步骤有，血管组织用5体积冷Tris/HCl(pH7.4)缓冲液匀浆，匀浆液过滤后离心两次(分别2000 r·min^－1， 20min)以沉淀线粒体。上清液再离心(120000 r·min^－1, 90 min)分离微粒体。用100mmol·L^－1,pH7.4的焦磷酸钠去除血红蛋白后，用磷酸钾缓冲液制成微粒体悬浮液，其蛋白终浓度为40 g·L^－1。取0.5mg微粒体加于0.4ml反应液中(含肝实质0.6mg，NADP 0.8 mmol·L^－1,6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶0.2 u)，最后加入50μl 0.25 mmol·L^－1的血红素作底物。混匀后置暗室37℃孵育10min, 用50μl 100g·L^－1HgCl₂终止反应。在分光光度仪上(λ/464～530nm)比色。HO活性用胆红素形成速率来表示。蛋白含量测定用考马斯亮蓝法。

HbCO生成测定采用Morita^［7］等的方法加以改良。主动脉平滑肌剪成3 mm大小组织块在DMEM培养液中(每15 mg 组织加纯Hb 1 mg)孵育1 h (37℃, O₂与 CO₂体积比为9∶1)。用双波长分光光度仪比色测定培养液中HbCO生成量，单位以μmol·L^－1表示。

统计学处理：结果用±s表示。组间差异用方差分析q检验。

2结果

2.1ZnPP-9对大鼠主动脉内膜剥脱后血管壁细胞³H-TdR掺入和MAPK活性的影响(表1)

表1各实验组血管³H-TdR掺入值和MAPK活性的变化(±s)

Table 1Changes of vascular³H-TdR incorporation and MAPK activity in various experimental groups (±s)

Group n f(³H-TdR incoor)

/min^－1☆ MAPK activity

(pmol·min^－1)^☆ Control 10 2 089±265 2 295±564 Balloon alone 8 4 894±386^** 5 492±378^** Balloon +ZnPP-9 8 6 589±478^**## 7 643±498^**## Balloon+HLL 8 3 452±465^**## 3 647±509^**##

**P＜0.01,compared with control; ##P＜0.01,compared with balloon alone group; ☆ per mg protein.无论是否加入ZnPP-9或HLL,球囊拉伤后血管³H-TdR掺入和MAPK活性均明显增加。拉伤加ZnPP-9组³H-TdR掺入值和MAPK活性分别比单独拉伤组增加34.6%和39.2%; 而拉伤加HLL组³H-Td