1半定量和定量PCR及定量核酸的方法

1.1内对照法

将已知的目的DNA及内对照DNA混合,加入两对引物同时进行PCR扩增,最后将PCR产物转膜,用特异性探针杂交,目的DNA扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对量进行比较即可确定^［1］。

1.2PCR杂交法(PCR-Hyb法)

合成的引物5′端连有生物素,所带有生物素的PCR产物一端可与标有辣根过氧化物酶的亲合素结合。另一端与酶标板上包被的特异性探针杂交。然后加入底物显色,呈色的程度与PCR产物浓度呈正比。

1.3分枝DNA法(b-DNA法^［2］)

两种特异性探针与待测的RNA杂交,其中一种探针的另一端与酶标板上的探针杂交。另一种探针的另一端与分枝DNA杂交,分枝DNA的另一端再与放入的酶标记的探针杂交。最后放入化学发光底物,底物在酶的作用下,产生光的强度与待测DNA或RNA浓度成正比。此方法有放大和定量的作用。

1.4PCR-杂交定量的荧光检测

PCR产物通过两个标有荧光团的探针进行杂交后，首先给第一个荧光团激发光,使它的发射光去激发第二个荧光团,荧光检测仪检测第二个荧光团发出的发射光来计算PCR产物。此方法的特异性很高。

1.5连续荧光检测PCR产物

在进行PCR扩增的同时,荧光染料SYBP^RGreenⅠ结合到双链DNA产物上,在一定温度下,连续监测荧光发射的最高峰,则可计算出PCR产物的量。

1.65′核酸酶分析(荧光定量PCR)

探针的5′端标有荧光团,3′端标有淬灭团。荧光团与淬灭团在一定距离内,淬灭团控制荧光团的发光。此探针杂交在待测的DNA上,然后放引物进行PCR扩增,当引物延伸到探针的5′端,切断探针5′端的荧光团,淬灭团失去控制荧光团的作用,则荧光团发出荧光。连续检测荧光的强度与待测的DNA浓度呈正比。

2PCR技术检测病原微生物的临床意义

如果原有检测技术的灵敏度和特异性基本上已达到临床需要，则不必一律采用PCR技术。

对于目前还没有其它诊断技术可以检测的疾病(如基因缺失、易位、突变)，需要培养时间较长或培养难度大的病原体的检测，则可考虑应用PCR方法。

如人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原(HIV-Ag)或抗体(HIV-Ab)的检测结果难以判断时，可用PCR技术作为确认手段。

用PCR和杂交方法对丙型肝炎(HCV)的基因分型、早期诊断和治疗监测的临床价值,已被国内外医学界所公认。

美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体的PCR或杂交检测试剂盒，也批准了HPV的过筛检测,对于HPV各型的检测,目前尚未批准。MTB的靶序列是16 SDNA的584 bp，其最后带有杂交检测。沙眼衣原体的检测试剂盒是1993年通过FDA批准,目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学法进行检测。但在美国通过CAP检查的某些教学医院实验室也可适量检测其它项目。

某些病毒、(如CMV^［3］、EBV等)支原体、细菌可在普通人体内存在,称条件致病病原体，所以检测这些病毒、支原体、细菌最好用定量PCR,复制数量要达到一定程度才考虑有临床意义。据国外文献报道,在严格的实验条件下,一些标本进行细菌培养结果和DNA结果不一致尚难以解释时，但对有临床症状病人的标本某些细菌培养结果是阴性,mRNA的检测结果呈阳性,应考虑体内的细菌在致病^［4］。

参考文献

1刘陶文. 定量PCR技术. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 1998,19:(1)15

2Gilliiand G,Perrin S,Blanchard K,et al. Analysis of cytokine mRNA and DNA:Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,87:2725-2729

3Storch GA,Ballei RS,Bailey TC,et al,Comparison of PCR and PP65 antigenemia assay with quantitative shell viral culture for detection of cytomegalovirus in blood leukocytes from solid organ transplant recipients. J Clin Microbiol, 1994,32(4):997-1003

4Rayner MG,Zhang y,Gorry MC．Evidence of bacterial metabolic activity in culture-negative otitis media with effusion.JAMA, 1998,279(4):296

(1998-10-12收稿)