RNA是分子生物学研究的一个重要组成部分， 不论是cDNA文库的构建、RT-PCR、RNA序列分析、差异显示（mRNA differential display）、代表性差异分析 (representational Difference Analysis, RDA)、抑制性消减杂交（suppression Subtraction Hybridization, SSH）、Northern印迹分析、蛋白质的体外翻译等均依赖于高纯度完整的RNA。 因此, 如何获得高质量的RNA是研究人员关注的问题。1987年Chomczynski等^［1］建立了酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法（acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC）。该方法较以往的传统方法操作简单，无需特殊的设备，抽提时间缩短至4 h，因而得到广泛的应用。数家公司据此开发出RNA提取试剂盒^［2，3］。使用试剂盒简单方便，但价格相对昂贵。为探索操作简便、经济实用、快速有效的RNA提取方法，我们分析了大量相关文献资料，进行了多次实验，成功地研制出一种新型的RNA提取试剂，建立了其操作程序，我们称之为RNA快速提取一步法。其性能达到进口试剂盒的水平，但造价低廉、操作简便，特别适用于国内实验室。

1材料与方法

1.1试剂

变性液（4 mol·L^－1异硫氰酸胍，25 mmol·L^－1柠檬酸钠pH 7.0，5 g·L^－1十二烷基肌氨酸钠,0.1 mol·L^－1β－巯基乙醇），按文献［1］方法配制；2 mol·L^－1的乙酸钠；重蒸酚；氯仿；异丙醇；8－羟基喹啉；柠檬酸；柠檬酸钠；乙酸；乙酸钠；800 ml·L^－1乙醇；RNAzol试剂盒(Promega 公司)；Trireagent (Sigma 公司)。

1.2仪器

电泳仪、岛津UV-160型紫外可见分光光度计（日本产）、超声匀浆仪（美国Sonics Material Inc. Jencons产品）、玻璃匀浆器。所用器皿均按RNA提取的一般要求进行处理^［4］。

1.3标本

大鼠脑组织、脊髓组织、培养细胞。

1.4RNA快速提取试剂的制备

1.4.1酸酚的平衡取重蒸酚于65℃水浴融化, 加入1 g·L^－18-羟基喹啉；用50 mmol·L^－1乙酸钠（pH 4.0）平衡。在平衡的过程中不断搅拌，并反复更换乙酸钠，待上清液相的pH值达到4.1为止。

1.4.2CSB缓冲液的配制用DEPC处理过的纯水配制CSB缓冲液，由42 mmol·L^－1柠檬酸钠、8.3 g·L^－1十二烷基肌氨酸钠和0.1 mol·L^－1β-巯基乙醇组成。

1.4.3快速RNA提取试剂的配制用CSB缓冲液配制4 mol·L^－1异硫氰酸胍；加入0.1体积4 mol·L^－1乙酸钠（pH4.0）, 加入等体积酸酚，0.02体积的异戊醇，混匀，即为RNA快速提取试剂。4℃保存备用。

1.5RNA快速提取程序

组织RNA的提取： 将约10～100 mg的组织块置于匀浆仪中，加入1 ml RNA快速提取试剂，进行匀浆；将匀浆液倾入1.5 ml离心管中，加入0.1体积的氯仿，振荡混合20 s；冰上放置5 min；4℃离心12000 r·min^－1, 15 min。离心管中的液体分为3层: 上层为无色透明的无机相，RNA保留于此相中；下层为呈淡黄色的有机相，蛋白质保留于此相中；上下两层的界面处为中间层，DNA保留于此相中。小心吸取上层水相约0.5 ml于新管中，切勿吸取中间层和下层液体，以避免DNA和蛋白质的污染。异丙醇沉淀：加入等体积的－20℃预冷的异丙醇，混匀，4℃离心12000 r·min^－1，15 min, 弃上清；用0.5 ml预冷的80％(体积分数)乙醇洗涤沉淀，弃尽乙醇，在空气中自然干燥，溶于适量DEPC处理的水中，用于后续的实验或－80℃保存。培养细胞RNA的提取： 培养细胞生长至旺盛期，弃掉培养基，用冰冷的PBS缓冲液冲洗两次，直接向细胞中加入1～2 ml RNA快速提取试剂，轻轻晃动培养瓶使细胞与RNA快速提取试剂充分接触，冰上放置5 min，吸出粘稠的细胞裂解混合物于新的离心管中，加入0.1体积的氯仿，振荡混匀。其余步骤与上述组织RNA提取方法相同。传统一步法提取RNA，按文献［1］方法进行；用Trireagent 或RNAzol提取RNA，按试剂盒说明操作。

1.6RNA的质量、纯度鉴定和浓度测定

取1～2 μl RNA样品在15 g·L^－1琼脂糖凝胶上进行电泳，检查RNA的质量，主要观察28S、18S和5S三条带是否清晰，有无降解，以及是否有DNA污染。

取1～2 μl RNA样品溶于1ml超纯水中，用紫外分光光度法测定D值。以D₂₆₀值计算其浓度，计算公式:

质量浓度(g·L^－1)=40×D₂₆₀×稀释倍数/1000

以D₂₆₀/D₂₈₀的比值表示其纯度，比值在1.8～2.0之间为纯的RNA，比值低于1.8，说明RNA样品有蛋白质或酚的污染，需要用氯仿重新抽提。

2结果

2.1RNA的完整性

用快速一步法提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，显示清晰的28 S，18 S和5 S三条带，表明RNA无降解、无明显的DNA污染，图1给出了一个代表性的实验结果，图2是用传统方法提取的电泳图，有较多的DNA污染。紫外分光光度法检查，图1脑组织RNA样品D₂₆₀/D₂₈₀的比值均在1.8～2.0之间，说明RNA未被蛋白质、酚污染，是高纯度的。用两种试剂盒提取的RNA与本法结果相似（图略）。用快速一步法提取的关节炎大鼠脊髓RNA作模板，进行DDRT-PCR，获得成功(图3)。

1，test;

图1用快速一步法提取大鼠脑组织RNA的电泳图

Figure 1Electrophoresis map of brain RNA by rapid one-step method

2,control.

图2用传统方法提取大鼠脑组织RNA的电泳图

Figure 2Electrophoresis map of brain RNA by acid-guanidine-phenol-chloroform (AGPC) method

图3关节炎大鼠脊髓组织RNA样品的差异显示结果

Figure 3Differential display map of spinal cord from arthritis rat

2.2操作程序的比较

快速RNA提取方法与传统的一步法相比，省掉了变性液复溶和异丙醇二次沉淀，同时也对其它参数进行了调整，使整个RNA的提取过程由原来的4 h缩短至1 h以内，这与试剂盒的方法一致，见表1。

表14种RNA提取方法的比较

Table 1Comparison of four RNA extraction methods

Steps AGPC method One-step method

(in this paper) RNAzol Trireagent Centrifuge 20 min 15 min 15 min 15 min Precipitation Isopropyl alcohol Isopropyl alcohol Isopropyl alcohol Isopropyl alcohol At least 60 min 15 min 15 min 15 min Centrifuge 20 min 10 min 10 min 10 min Re-dissolve Denature Solution no no no Re-precipitation30 min no no no Centrifuge 10 min no no no Washing 800 ml·L^－1 ethanol 800ml·L^－1 ethanol 800ml·L^－1 ethanol 800ml·L^－1 ethanol Dissolve H₂O H₂O H₂O H₂O Total time 240 min 60 min 60 min 60 min

2.3RNA快速提取试剂的稳定性

在实验中发现，按传统一步法配制的变性液稳定性不好，易出现浑浊，甚至析出结晶等不良现象。我们配制的RNA快速提取试剂4℃长期保存无浑浊、结晶析出等不良现象。用4℃保存3个月、6个月和12个月的试剂分别提取RNA，进行琼脂糖电泳鉴定无降解，表明该试剂具有很好的稳定性，可以长期保存使用，有效期至少是1年。

2.4匀浆方式对RNA质量的影响

在实验中我们发现不同的匀