动脉粥样硬化是危害人类健康最严重的疾病之一。近年研究发现,高同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)血症是动脉粥样硬化的一个独立的、重要的危险因素。现已证明,它可引起内皮损伤、刺激血管平滑肌细胞增殖、促进胶原形成、诱导血小板聚集,促进动脉粥样硬化形成^［1～5］。本工作在培育的大鼠VSMC上,观察牛磺酸及L-精氨酸HCY诱导的VSMC增殖的影响。

1材料与方法

1.1血管平滑肌细胞培育

取SD大鼠胸主动脉,按Ross方法分离和传代培养。用体积分数为20%小牛血清的DEME培养液,实验用第4代细胞。

1.2VSMC³H-TdR掺入

按每孔5×10⁵细胞数接种于24孔板,加体积分数为20%小牛血清的DEME培养液培养24 h,贴壁后换用体积分数为0.5%小牛血清的DEME培养液再培养24 h,然后按下列分组加入不同药物进行实验。(1)对照组:只加PBS;(2)HCY组0.1 mmol·L^－1 HCY;(3)L-精氨酸组:10 mmol·L^－1 L-精氨酸;(4)TAU组:10 mmol·L^－1牛磺酸;(5)HCY+L-Arg, 0.1 mmol·L^－1 HCY+5,10, 20 mmol·L^－1L-精氨酸;(6)HCY+TAU, 0.1 mmol·L^－1 HCY+5,10,20 mmol·L^－1牛磺酸;(7)HCY+L-arg+TAU:0.1 mmol·L^－1 HCY+5,10 mmol·L^－1 L-精氨酸+5,10 mmol·L^－1牛磺酸。同时加入37 kBq³H-TdR培养24 h后加入冷PBS终止反应。在Millipore上经微孔滤膜(0.25 μm)收集并洗净细胞,并用100 g·L^－1三氯醋酸处理,滤膜置于闪烁瓶中,加入闪烁液,在液体闪烁计数仪上测量³H的放射活性。

1.3材料

SD大鼠由北京医科大学动物实验中心提供;HCY,L-精氨酸,牛磺酸均为Sigma公司产品,³H-TdR购自中国原子能研究所,其余试剂均为国产分析纯。

1.4统计学处理

每次双平行管操作,实验重复3次,实验数据以±s表示;one-way ANOVA和组间q检验作统计学处理。

2结果

0.1 mmol·L^－1 HCY可使培养的兔VSMC³H-TdR掺入增加5.7倍［control:(46±10)×10^－3 pmol vs HCY:(310±48)×10^－3 pmol, P＜0.01］,而单纯用L-精氨酸及牛磺酸对VSMC³H-TdR掺入无影响［control:(46±10)×10^－3 pmol vs L-精氨酸:(46±8)×10^－3 pmol或牛磺酸(47±6)×10^－3 pmol, P＜0.05］, 但是它们可呈剂量依赖性地抑制HCY诱导的VSMC增殖。5, 10, 20 mmol·L^－1 L-精氨酸可分别使HCY诱导的VSMC³H-TdR掺入降低11%, 35%, 48% (P＜0.01); 5,10,20 mmol·L^－1牛磺酸可分别使HCY诱导的VSMC³H-TdR掺入降低11%, 47%, 54% (P＜0.01，表1)。合用牛磺酸+L-精氨酸(5, 10 mmol·L^－1)可分别使HCY诱导的VSMC³H-TdR掺入降低59%和65%(P＜0.01);合用牛磺酸+L-精氨酸对VSMC增殖的抑制效应大于单纯应用L-精氨酸及牛磺酸组(P＜0.01，表1) 。

表1牛磺酸和L-精氨酸对HCY诱导的VSMC增殖的影响

Table 1The influence of L-arginine and taurine on HCY-induced VSMC proliferation

c(L-Arg

or TAU)

/mmol·L^－1 n(³H-TdR incorporation)/fmol HCY HCY+L-Arg HCY+TAU HCY+L-

Arg+TAU 5 310±48 276±47 275±45 126±29^**## 10 310±48 201±49^** 164±37^** 108±34^**＃ 20 310±48 160±38^** 144±47^**

TAU, taurine; HCY， 0.01mmol·L^－1, ** P＜0.01, vs HCY; # P＜0.05,## P＜0.01,vs HCY+L-ARG or HCY+TAU.3讨论

HCY是甲硫氨酸代谢过程中产生的一种含硫氨基酸。VSMC增殖是动脉粥样硬化的一个主要病理特征。Tsai等^［4］报道HCY可通过MAPK、核内癌基因和细胞周期调控蛋白信息传导途径刺激VSMC增殖。此外,大量的文献显示,牛磺酸和L-精氨酸有抑制VSMC增殖的作用,因此,本工作观察了牛磺酸及L-精氨酸对HCY诱导的VSMC增殖的抑制作用。

我们首次发现L-精氨酸及牛磺酸可呈剂量依赖性地抑制HCY诱导的VSMC增殖。有关L-精氨酸及牛磺酸抑制HCY诱导VSMC增殖的机制尚不清楚。L-精氨酸是一种碱性氨基酸,它是NO合成的前体,可通过NO抑制VSMC增殖、扩张血管、抑制血小板聚集。有人报道,NO与HCY作用形成巯基亚硝酸盐,后者可扩张血管,抑制血小板聚集^［5］。牛磺酸也是一种含硫氨基酸,它具有稳定细胞膜,调节钙稳态,抑制VSMC增殖等多种生物学效应^［6，7］。已有文献报道,牛磺酸可抑制内皮素,血管紧张素Ⅱ等多种因素引起的VSMC增殖^［7］。

混合应用牛磺酸和L-精氨酸具有协同或叠加抑制作用，这与我们在内皮剥脱模型上的研究结果类似。L-精氨酸和牛磺酸均是机体的内源性物质,即使补充很大剂量,亦无毒副作用;且均是小分子物质,无抗原性,各种途径给药均可,且价廉易得。因此,探讨L-精氨酸、牛磺酸及其混合液抑制HCY诱导VSMC增殖的机制,以及对动脉粥样硬化的治疗是非常有价值的,值得深入研究。

参考文献

1Harker LA， Ross R, Slichter ST， et al. Homocysteine-induced arterosclerosis. The role of endothelial cell injury and platelet response in its genesis. J Clin Invest, 1976,58:713-741

2Velend PM, Refsum H. Plasma homocysteine, a risk for vascular disease:Plasma levels in health, disease and drug therapy. J Lab Med, 1989, 114:473-501

3Malinow MR. Hyperhomocyst(e)inema: a common and easily reversible risk factor occlusive atherosclerosis. Circulation, 1990, 81:2004-2006

4Tsai JC, Perrele MA, Yoshizumi M, et al. Promotion of vascular smooth muscle cell growth by homocysteine: a link to atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:6369-6374

5Dalton ML, Gadson PF, Wrenn RW. Homocysteine signal cascade: production of phospholipids, activation of protein kinase C, and the induction of c-fos and c-myb in smooth cells. FASEB J, 1997, 11:701-711

6Huxtable RJ. Physiological action of taurine. Physiol Rev, 1992, 72:101-163

7牛大地,张居馨,迟学栋，等.牛磺酸抑制大鼠平滑肌细胞增殖.北京医科大学学报, 1993,24:225-227

(1998-08-27收稿)