摘要目的：观察DNA与骨骼肌肌质网蛋白结合后对肌质网功能的影响。方法：应用差速离心分离大鼠骨骼肌肌质网，并用⁴⁵CaCl₂作为示踪剂，观察质粒DNA pcDNA3和pcDNA3/ANF对肌质网钙转运功能的影响。结果：两种质粒均可明显增加肌质网Ca²⁺摄取，呈明显的量效关系，并且也可促进肌质网钙释放。结论：外源质粒DNA可影响肌质网钙转运功能。

中国图书资料分类法分类号R337.1-332

Effects of plasmid DNA on sarcoplasmic reticulum Ca²⁺ transport in rat skeletal muscle

ZHAO Wen^#， LI Zai-Quan， JIANG Zhi-Sheng， TANG Jian ， JIA Hong-Ti， LIU Nai-Kui， TANG Chao-Shu

(#Institute of Cardiovascular Research， Beijing Medical University, Beijing100083)

ABSTRACTObjective: To observe the effect of plasmid DNA binding to sarcoplasmic reticulum (SR) non-nuclear DNA binding proteins on SR function.Methods: SR vesicles of rat skeletal muscle were prepared by differential centrifuge. Effects of plasmids pcDNA3 and pcDNA3/ANF on SR Ca²⁺ transport were investigated by using⁴⁵CaCl₂ as tracer.Results: Both plasmids could increase SR Ca²⁺ uptake significantly, which had significant dose-dependent relation and increased SR Ca²⁺ release.Conclusion: Plasmid DNA could influence SR Ca²⁺ transport.

MeSHPlasmidsDNA-binding proteinsCalcium/metabMusculoskeletal system

机体组织细胞内广泛存在DNA结合蛋白，主要分布于核内，作为转录调控因子调节核内基因的转录和表达。最近，Hagstrom等^［1］研究发现，在分离的家兔骨骼肌肌质网(sarcoplasmic reticulum, SR)上存在DNA结合蛋白，相对分子质量分别为95000、60000和28000，称为非核DNA结合蛋白。本实验室在分离的大鼠骨骼肌SR中也发现了两种非核DNA结合蛋白，相对分子质量为83000和58000^［2］。但是肌质网上存在的这类非核DNA结合蛋白的生物学意义目前尚不清楚。本实验在分离的大鼠骨骼肌肌质网上，观察了2种质粒DNA(即pcDNA3和pcDNA3/ANF)与蛋白结合后对肌质网Ca²⁺摄取及释放的影响，以探讨非核DNA结合蛋白的功能意义。

1材料与方法

1.1动物及试剂

雄性Wistar大鼠，体重150～250g，由北京医科大学动物部提供；⁴⁵CaCl₂为Amersham公司产品；其余试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.2大鼠骨骼肌肌质网囊泡的制备

参照Ohlendieck等^［3］的方法，取Wistar大鼠后肢骨骼肌组织20g，冰浴中剪碎后匀浆，差速离心10000r·min^－1,15min；16000 r·min^－1,30min；30000 r·min^－1,30min。4 ℃,沉淀即为SR膜囊泡粗提物，考马斯亮蓝法进行蛋白定量，并贮存于－80℃备用。

1.3质粒DNA的制备

质粒pcDNA3，购自Invitrogen公司。质粒pcDNA3/ANF为本室构建，即在pcDNA3的多克隆位点插入心钠素（atrial natriuretic peptide, ANF）全长cDNA，质粒经转化大肠杆菌进行扩增，用聚乙二醇纯化，获得闭合环状DNA，－20℃贮存备用。

1.4大鼠骨骼肌肌质网Ca^2＋摄取功能测定

参照Ortega等^［4］的方法测定SR Ca^2＋ 摄入，反应体系每管200μl，反应混合液组成（mmol·L^－1）：KCl 100，MgCl₂ 5, CaCl₂ 0.05，HEPES 10，pH 7.1， 含200μg SR蛋白，3.7×10⁴Bq(1μCi) ⁴⁵CaCl₂。加入5mmol·L^－1 Na₂-ATP 37℃ 启动Ca^2＋摄取反应, 反应时间30min,经微孔滤膜抽滤后液闪测定

⁴⁵Ca²⁺放射强度。质粒DNA处理组分别应用pcDNA3及pcDNA3/ANF 10、20、30μg预先与肌质网蛋白共同孵育30min，然后测定SR Ca²⁺摄取功能。

1.5大鼠骨骼肌肌质网Ca²⁺释放功能测定^［4］

大鼠骨骼肌SR主动负载⁴⁵Ca²⁺反应体系及反应过程同上，37℃孵育30min后，离心12000 r·min^－1，5min，弃上清，沉淀洗涤后，每管加入释放液(mmol·L^－1: KCl 80, Tris-HCl 20，pH6.8, caffeine 10) 400μl，并分别于1，3和5min各取100μl，测定⁴⁵Ca²⁺放射活性。质粒DNA处理组分别应用20μg pcDNA3及pcDNA3/ANF与肌质网膜蛋白共同孵育30min, 而后测定SR Ca²⁺释放功能。

1.6统计学处理

所有数据均用±s表示，两组之间比较用t检验，多组之间比较用方差分析，P＜0.05认为差异具有显著性。

2结果

2.1质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF对大鼠骨骼肌肌质网Ca²⁺摄入的影响

大鼠骨骼肌SR Ca²⁺摄入作用呈时间及蛋白浓度依赖性，结果分别见图1A及1B所示。质粒DNA预先孵育后的SR Ca²⁺摄入明显增加，且与质粒DNA呈剂量依赖关系；pcDNA3 10、20和30μg预孵育后，SR Ca²⁺摄入分别较对照增加18%，54%和72%（均P＜0.01）；同样，pcDNA3/ANF 10、20和30μg预孵育后，SR Ca²⁺摄入分别较正常增加34%、50%和79%（均P＜0.01），两种质粒之间比较无显著性差异（P＞0.05），结果如图2所示。

2.2质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF对大鼠骨骼肌肌质网Ca²⁺释放的影响

在对照组，预先负载⁴⁵Ca²⁺的骨骼肌SR Ca²⁺释放随时间而增加，1、3和5min释放量分别为每mg蛋白(0.31±0.03)、(0.65±0.04)和(1.27±0.07) nmol, 约为负载量的25％±9.2%、52％±5.3%和100%,5 min时几乎全部释放。实验组加入20 μg质粒DNA pcDNA3及pcDNA3/ANF与SR预孵育后SR Ca²⁺释放速度较对照组均明显增快，其中质粒pcDNA3处理组，1min及3min⁴⁵Ca²⁺释放量为负载量的85％±6%及90%±8%，与对照组相比差异显著（均P＜0.01）; 质粒pcDNA3/ANF处理组，1min及3min⁴⁵Ca²⁺释放量为负载量的83%±11%及92%±7%，较对照组明显加快(均P＜0.01); 但两种质粒之间比较无显著性差异（P＞0.05），结果如图3所示。

A， time-course curve； B， dose-dependent curve； n=5.

图1正常大鼠骨骼肌SR 钙摄入的时效曲线和量效曲线

Figure 1The time-course curve and dose-dependent curve

of SR calcium uptake in normal rat skeletal muscle

3讨论

1996年Hagstrom等^［1］首次报道，家兔骨骼肌SR上存在有DNA结合蛋白，相对分子质量分别为95 000，60 000和28 000，称为非核DNA结合蛋白。本室在大鼠骨骼肌SR上也发现存在DNA结合蛋白，相对分子质量为83000和58000，并证实SR上存在的这类DNA结合蛋白与双链线状、环状及单链DNA的结合均无选择性，因此称为DNA序列非依赖性的非核DNA结合蛋白^［2］。本工作在分离的大鼠骨骼肌SR上发现，质粒DNA pcDNA3及pcDNA3/ANF预先与SR上DNA结合蛋白结合后，SR Ca²⁺的摄入与释放功能均明显增强，即turnover加快，随机选用pcDNA3作为真核表达空载体代表，pcDNA3/ANF作为携带外源目的基因的嵌合质粒代表，结果显示两者对SR Ca²⁺转运作用类似，提示这一作用亦表现为非DNA序列依赖性。

^**P＜0.01, compared with control, n=5.

图2质粒pcDNA3和pcDNA3/ANF对肌质网钙摄取的作用

Figure 2Effect of plasmid pcDNA3 and pcDNA3/ANF

on SR calcium uptake

^** P＜0.01, compared with control,n=5.

图3<