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中国图书资料分类法分类号R659-332
Transplantation tolerance to mice skin allografts induced
with irradiate and non-irradiate protocols
YUAN Xue-Li＃, SONG Xian-Yuan, XIE Shu-Sheng, GUO Ying-Lu
(#Institute of Urology, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing100034)
ABSTRACTObjective: To establish a transplantation tolerance induction protocol which might be applied in clinical situation in the future.Methods: Fully MHC-mismatched male BALB/c (H-2d) and female C57BL/6 (B6, H-2b) mice were used as skin transplantation donors and recipients, respectively. Before operation B6 mice were conditioned with 5Gy whole body irradiation (WBI), 0.1 ml ALS (antilymphocytic serum)injection for three times, 3×107 donor bone marrow cells transfusion (BMT), 150 mg·kg－1 cyclophosphamide(CP) separately or combinatively.Results: When ALS was used combinatively with BMT and CP, the allograft survival was significantly prolonged, mean survival time was 23.6 days, just as the result of WBI+BMT induction.Conclusion: Transplantation tolerance can also be induced by non-irradiate pretreatment.
MeSH Skin transplantationImmune toleranceGraft survival/rad eff
诱导器官移植受体对供体器官特异性的移植耐受，是防止移植排斥反应、使移植物长期存活的理想方法。我们通过5Gy全身照射（whole body irradiation, WBI）、骨髓细胞输注（bone marrow cells transfusion, BMT）、及环磷酰胺（cyclophosphamide, CP）腹腔注射，成功地诱导MHC完全不同的BALB/c（H-2d）和C57BL/6（H-2b）小鼠的皮肤移植耐受。本文欲探索一种非照射性的、较易于临床常规应用的移植耐受诱导方法， 为临床延长移植器官的存活、提高存活率提供一种简单易行的方法。
1材料与方法
1.1抗淋巴细胞血清的制备
根据小鼠脑细胞与T细胞具有共同抗原（Thy-1抗原）的特点，按Mishell和Shiigi的方法［1］制取兔抗小鼠淋巴细胞血清（antilymphocytic serum, ALS）。具体步骤如下：小鼠放血后取脑，每1.5个鼠脑加入1.5 ml平衡盐溶液，用玻璃组织匀浆器制成匀浆，将匀浆与同体积完全福氏佐剂制成乳剂。每1.5个鼠脑制成的抗原免疫一只家兔，分4点后腿肌肉注射。制取的抗血清用成年鼠的骨髓细胞进行吸收以去除种特异性抗体，活体染料摄入法进行细胞溶解活性测定，1∶128(体积比)稀释后特异性的细胞毒性为95%。
1.2实验动物
8～12周龄雄性BALB/c（H-2d）小鼠与雌性C57BL/6（H-2b）（B6）小鼠分别作为皮肤移植的供、受体；雄性昆明鼠作为无关第三品系，用以检测移植耐受状态的特异性。以上动物及制备抗淋巴细胞血清用大白兔均由北京医科大学实验动物学部提供。
1.3耐受诱导及皮肤移植的实验分组
作为皮肤移植受体的B6小鼠在移植前、后分别或同时接受如下处理：移植前3 d开始ALS 腹腔注射每天 0.5 ml连续3 d，；移植前1d 5 Gy全身照射（WBI）；移植当天3×107供体骨髓细胞静脉输注（BMT）；皮肤移植后第2天腹腔注射环磷酰胺每kg体重150 mg（CP）。具体实验分组如下：第1组：无处理对照；第2组：WBI＋BMC；第3组：ALS＋WBI＋BMC；第4组：ALS＋BMC＋CP。
1.4移植物存活及受体细胞免疫状态检测
1.4.1皮肤移植物存活情况的观察皮肤移植后1周开始每日观察移植物的颜色、硬度、有无结痂、脱落及毛发生长。如皮片变硬或结痂脱落，则判定为移植排斥，红润、柔软或鼠毛生长则认为存活或耐受。
1.4.2混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction, MLR）于移植后30 d，每实验组各取3只B6小鼠，放血后处死，取脾，制成脾细胞悬液，调至每毫升2×107细胞，作为反应细胞。另取3只正常BALB/c和昆明鼠的脾，制备相同细胞数浓度的脾细胞悬液，作为刺激细胞。每毫升细胞悬液加入含0.5 mg·ml－1丝裂霉素C的Hanks溶液50μl，以此处理刺激细胞和一个等分的反应细胞，以抑制其增殖。对照和实验培养均作3个复制培养。置37℃下5％ (体积分数) CO2孵箱孵育72 h后，用MTT法检测细胞的增殖情况，即离心去上清后每孔加入用RPM1640溶液（不加血清和二巯基乙醇）配制成的1mg·ml－1MTT溶液50 μl，孵育3 h再次离心培养板，小心弃去上清，每孔加入异丙醇120 μl，震荡，使染料充分溶解。用ELISA阅读计采用600 nm波长测各孔光密度值，以实验组与对照组的光密度值之差作为各实验组的增值指标。
1.4.3诱导迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity, DTH）输骨髓后第30天，用Hanks液将BALB/c小鼠的脾细胞调至每毫升1×108，在各实验组C57小鼠腹股沟皮下注射1×107供体脾细胞（0.1 ml），7 d后于右后脚掌注射1×107（50μl）个相同的脾细胞，左后脚掌注射50 μl Hanks液，24 h后用游标卡尺测量两个脚掌的厚度，取二者之差作为DTH指标。
2结果
2.1移植物存活
小鼠皮肤移植物的存活情况如表1所示，第1组正常对照B6小鼠的皮肤移植物，在移植后第8天开始被排斥，第13天时全部皮肤移植物无一存活，平均存活10.6 d；第2组，当受者小鼠在5 Gy照射基础上，尾静脉输注3×107供体BMC，则移植物存活明显延长，移植后第13天才出现排斥反应，存活最长者达31d，平均存活20.3 d，与第1组比较差异有显著性；第3组，皮肤移植受体小鼠在第2组基础上，于移植前连续应用ALS 3 d，移植物平均存活28.9 d，较第2组延长，但由于两组个体之间变异太大，经统计学处理差异没有显著性。第4组，当去除照射，将ALS与CP组合，移植物的存活与第2组相似，较第1组延长，平均存活期为23.5 d，与第2组比较差异没有显著性。在所有实验组中，移植的昆明鼠的皮肤均在12 d内被排斥。
2.2混合淋巴细胞反应(MLR)
各组皮肤移植小鼠在移植30 d后的MLR结果如图1所示，所有进行耐受诱导的B6小鼠的脾细胞，其对丝裂霉素处理的BALB/c小鼠脾细胞的增殖反应均明显降低，尤其以第3组降低最显著，而对昆明鼠脾细胞的增殖反应与正常B6小鼠脾细胞对BALB/c脾细胞的增殖反应无明显差别。
2.3迟发型超敏反应(DTH)
正常B6小鼠的对BALB/c脾细胞抗原的DTH非常明显，5只实验小鼠的右后足掌发红及肿胀明显，以两足掌厚度之差(mm)表示的DTH指数为0.36±0.04(±s)。第2和第3组B6小鼠DTH反应引起的足掌肿胀明显减轻，其DTH指数分别为0.18±0.05和0.15±0.05(±s),对两组均数进行t检验，与第1组比较差异均有显著性(P＜0.001)。但在第4组，DTH又有所增强，DTH指数为0.26±0.07，但仍低于正常对照组(P＜0.05)。
3讨论
近年来，有些诱导移植耐受的方法，常涉及全身或淋巴组织照射，这些方法虽然有效，但临床不易接受。目前根据T细胞活化的“双信号”理论，应用阻断CD28/B7通路诱导移植耐受也取得了较好的效果［2］，但在目前国内条件下，临床大量使用CTLA4-Ig尚难推广。通过胸腺内注射抗原也在鼠类研究中取得肯定的效果［3］，但成年人胸腺退化，其应用前景尚待探索，同时，操作不便也限制了它的临床应用。
表1不同方法处理小鼠的皮肤移植物存活时间(±s)
Table 1The survival time of skin allografts
of differently treated mice (
