摘要目的：研究延迟整流性K⁺通道在人肝癌细胞增殖中的作用。方法：采用膜片钳技术的全细胞记录方式记录人肝癌细胞在不同浓度EGF中延迟整流性K^＋通道的跨膜电流。利用氚标记的胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)掺入技术观察EGF和K^＋通道阻断剂(TEA)对人肝癌细胞DNA合成的影响。结果：发现表皮生长因子（EGF）促进肝癌细胞增殖的同时使肝癌细胞膜离子通道的跨膜K⁺电流增加。K⁺通道阻断剂四乙胺（TEA）能显著抑制EGF促进DNA合成的作用，具有明显的量效关系和时间依赖性，但对细胞的活力无明显影响。结论：人肝癌细胞的增殖活动需要延迟整流性K⁺通道参与。

中国图书资料分类法分类号R735.7

The role of delayed rectifier K^＋ channel

in the proliferation of the human hepatocyte carcinoma cells

FU Wei^＃, ZHOU Xiao-Si , ZHANG Zong-Ming, ZHOU Pei-Ai, WU Cai-Hong

(#Department of General Surgery, the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing100083)

ABSTRACTObjective: To study the role of the delayed rectifier K⁺ channel in the proliferation of the human hepatocyte carcinoma cells.Methods: The transmembrane current of human hepatocyte carcinoma cells was recorded by the whole-cell recording technique of patch clamp in different concentration of EGF. The effect of EGF and K^＋ channel blocker on the DNA synthesis of human hepatic carcinoma cells was observed by³H-TdR incorporation technique.Results: EGF promoted the cell proliferatetion of the human hepatocyte carcinoma cells. At the same time, EGF made the K⁺ channel current of hepatocyte carcinoma cells increased. TEA of K⁺ channel blocker could significantly inhibited DNA synthesis induced by EGF. There was a linear relationship between the concentration of TEA and the effect of inhibition as well as time-dependence. But TEA didn't reduce the viability of hepatocyte carcinoma cells.Conclusion: K⁺ channel was necessary for the proliferation of the human hepatocyte carcinoma cells.

MeSH Delayed rectifier K^＋ channel^☆Carcinoma hepatocellular/metabPotassium channels

Endothelial growth factor/pharmacol

在淋巴细胞^［1］、人的乳癌细胞系MCF-2^［2］、人黑色素瘤细胞^［3］中各种K⁺通道与细胞的增殖有关。本实验是在我们发现人肝癌细胞存在延迟整流性K⁺通道的基础上^［4］，研究K⁺通道在人肝癌细胞系BEL-7402细胞增殖中的作用。

1材料与方法

1.1细胞系

人肝癌细胞系BEL-7402由北京医科大学药学及化学分析中心赠送。

1.2主要仪器

电极拉制器(Narishige, PP-83, Japan)，EPC-7膜片钳放大器(List, Darmstadt Co., Germany)，5.5.1版PClamp电信号采集程序、数据采集系统(Axon Instrument, Inc., USA)。

1.3主要试剂

盐酸四乙胺(TEA-Cl),Mg-ATP,KF均为Sigma产品。RPMI1640培养基(Gibco)，EGF(Boehringer Mannheim),³H-TdR(上海原子能研究所)。

1.4细胞外液和电极液的配制以及玻璃微电极的制备

细胞外液和电极液的配制以及玻璃微电极的制备见参考文献［4］。

1.5人肝癌细胞系BEL-7402细胞的准备

当细胞在培养瓶中长成单层后，转入35 mm×10mm的培养皿或培养板中继续培养48 h后,按试验要求在各个培养皿中分别加入一定量的EGF、TEA，或者兼有二者的RPMI1640培养液继续培养24 h。最后以全细胞方式记录细胞的跨膜电流，同时进行细胞计数，测定³H-TdR掺入的cpm值。

1.6全细胞膜片钳记录

倒置显微镜下,在微操纵器操纵下，进行全细胞膜片钳的记录(室温下)。

1.7数据处理及统计分析

计量资料以±s表示，并采用t检验或方差分析进行显著性检验，对二组数据的相关性采用直线回归的方法，对相关系数进行检验。

2结果

2.1EGF对肝癌细胞延迟整流性K⁺通道的影响

不同质量浓度的EGF加入细胞的培养液中培养24 h后，用膜片钳的全细胞记录方式记录细胞的跨膜电流，在钳制电压(holding potential, HP)=－100mV，测试电压（test potential,TP）=－100～90mV条件下，不同TP的跨膜电流I_TP均增高(表1)。EGF对肝癌细胞膜的延迟整流性K⁺通道电压门控特性有影响，使跨膜电流增强。

2.2EGF对肝癌细胞计数的影响

细胞在含有0、1、10、20 μg·L^－1EGF的培养液中分别培养24 h后，细胞计数分别为32±5(×10⁴个，n=4)、35±7(×10⁴个，n=4)、47±7(×10⁴个，n=4)、56±11(×10⁴个，n=4)。表明EGF使细胞数目明显增加，促进细胞的增殖。

2.3对肝癌细胞活力的影响

在含有10 μg·L^－1 EGF的培养液中培养的细胞，分为2组，分别加入终浓度0和20mmol·L^－1 TEA培养24 h后，用4 g·L^－1台盼蓝染色进行细胞活力鉴定。TEA组细胞存活率为0.918［279(个)/304(个)］，而未加TEA组为0．946［315(个)/333(个)］，两者差异无显著性(χ²=2.005 3，P=0.156 8)。

2.4EGF本身和EGF加K⁺通道阻断剂(TEA)对肝癌细胞DNA合成的影响

2.4.1EGF本身对肝癌细胞DNA合成的影响细胞在含有不同质量浓度EGF的培养液中分别培养24 h后，³H-TdR掺入后测定cpm（图1中Without TEA组），EGF明显促进DNA的合成。

表1不同质量浓度的EGF对人肝癌细胞系BEL-7402

细胞跨膜电流I_TP的影响(±s)

Table 1The effect of different mass concentration of EGF

on the transmembrane current of carcinoma cells

of cell line BEL-7402(±s)I/pA

TP

(mV) ρ(EGF)/μg·L^－1 0(n=12) 1(n=11) 10(n=12) 20(n=9) －100 －63±35 －64±30 －79±22 －82±21 －90 －46±34 －38±25 －49±27 －39±24 －80 －23±37 －15±23 －9±33 6±39 －70 －2±42 9±31 33±29 53±60 －60 24±45 35±42 69±34 110±78^ －50 50±49 57±53 113±42^ 155±92^ －40 82±63 86±66 154±47^ 206±101^ －30 112±80 123±81 208±42^ 259±112^ －20 142±92 164±96 264±47^ 316±125^ －10 175±110 211±114 326±55^ 378±128^ 0 217±124 268±131 387±67^ 445±134^ 10 261±143 328±146 450±78^ 515±139^ 20 301±166 407±154 516±88^ 606±130^