摘要目的：从亚硝化食品中分离鉴定N-亚硝酰胺。方法：用高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）-光水解热裂解-热能分析仪联机技术，从胃癌高发区食品鱼露亚硝化产物中直接分离、测定和制备热不稳定性N-亚硝酰胺色谱组份；利用HPLC-电喷雾离子化-质谱计和HPLC-紫外光谱仪联机技术，对该色谱峰的制备组份进行结构确证。结果：从亚硝化鱼露中直接分离到一种热不稳定性N-亚硝基化合物，其色谱保留时间与N-甲基亚硝基脲（N-nitrosomethylurea, NMU）相同；进行结构确证研究发现，该色谱峰的质谱特征峰(m/z 64、102、145)及紫外吸收光谱(λ_max=230 nm)与NMU标准品相同。结论：实验结果充分说明该色谱峰含NMU，首次直接证明了亚硝化食品中存在NMU。

中国图书资料分类法分类号R735.2

Separation and identification of N-(nitrosomethyl)urea

in fish sauce from high risk area of stomach cancer

DENG Da-Jun^＃, YANG Shu-Min, LI Tong, XIN Hui-Jun

(＃School of Oncology, Beijing Medical University(BICR)， Beijing100034)

ABSTRACTObjective:To identify chemical carcinogens in nitrosated food.Methods: Fish sauce samples from a high risk area for stomach cancer were nitrosated under simulated human stomach conditions. The chromatographic components of thermal-unstable N-nitrosamides were separated, detected, and prepared directly with high performance liquid chromatography (HPLC)-photohydrolysis-pyrolysis-thermal energy analyzer. The chemical structure of one of the components was compared with authentic N-(nitrosomethyl)urea (NMU) by HPLC-electronic spray ionization-mass spectrometer and HPLC-UV diode array detector.Results: One thermal-unstable N-nitroso compound was separated from nitrosated fish sauce sample. Its retention time was the same as that of the authentic NMU. The corresponding chromatic fraction of the chemical showed also the same mass spectrum (m/z values 64, 102, 145) and spectrum of ultraviolet-absorbency (λ_max=230 nm) as those of NMU.Conclusion: These results proved that the component was NMU. This is the first report that there is NMU in nitrosated food.

MeSHGastric neoplasmaFishFoodN-(nitrosomethyl)urea^☆Nitrosourea compounds/isol

胃癌死亡率仍居我国恶性肿瘤之首，N-亚硝酰胺类化合物(N-nitrosamides, NAD)可能是人胃癌发生的主要启动因素^［1，2］。由于NAD化学稳定性差，既往长期缺乏有效检测手段，迄今没有诸如人体内外环境中天然性NAD的种类、化学结构、分布和代谢以及危害性等资料，使得人胃癌NAD病因理论缺乏一块重要基石。近年高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)与NAD光水解/热裂解器(photolysis and pyrolysis, PHPS)-热能分析仪(thermal energy analyzer, TEA)或类似联机检测方法的建立^［3］，使得分离鉴定人体内外环境中亚硝酰胺成为可能。胃癌高发区居民食用的鱼露在类似人胃内条件下亚硝化后能诱发大鼠胃腺癌^［4］，本文利用HPLC-PHPS-TEA等多种分离鉴定手段，首次直接证明亚硝化鱼露样品(N-nitrosated fish sauce, NFS)中存在N-甲基亚硝基脲(N-nitrosomethylurea, NMU)。

1材料与方法

1.1试剂和样品

NMU标准品(Sigma)、乙腈(acetonitrile, BDH)、国产丙酮(acetone, AR)和二氯甲烷(dichloromethane, AR)经重蒸纯化后使用。鱼露样品采自胃癌高发区福建长乐市古槐乡。

1.2样品亚硝化、纯化、浓缩

参考文献［4］方法进行。10 ml鱼露在37℃水浴和pH2.0条件下亚硒酸钠（5 mmol·L^－1）孵育1 h，沉淀去蛋白，丙酮/二氯甲烷萃取，旋转蒸发至干,供次日HPLC-PHPS-TEA分离测定或制备分离使用。加入样品中的NMU标准品的绝对回收率约为50％。

1.3样品NAD色谱分离测定

用10 mmol·L^－1三氟乙酸2ml溶解10ml NFS的萃取浓缩物，按文献［3］方法，以Hamilton PRP-1(10 μm, 150 mm, 4.1 mm内径)反相HPLC分析柱、10 mmol·L^－1三氟乙酸和体积分数为0～22%的乙腈流动相，流速1.0 ml·min^－1，对鱼露样品纯化浓缩物中的NAD进行HPLC (Waters 510)-PHPS-TEA (510, Thermal Electr. Co., USA)法梯度洗脱分离测定。对NFS萃取物进行柱后光水解和不光水解比较测定，以确定色谱峰的热不稳定性。

1.4NAD色谱组份制备、浓缩

将60 ml NFS的浓缩物溶解于1.2 ml的10 mmol·L^－1三氟乙酸流动相中，按文献［3］方法建立样品NAD的Hamilton PRP-1半制备柱(10 μm, 305 mm, 7.0 mm内径)分离方法，进样量改为120 μl、流速改为2.5 ml·min^－1，将1/3的流动相从柱后引入PHPS-TEA检测器，测定待制备色谱峰的保留时间，收集保留时间前、后1 min之间的流动相，对收集组份进行再次萃取和浓缩（至1 ml），－20℃保存，供次日进行波谱测定使用。

1.5HPLC-质谱(mass spectrum, MS)测定

首先建立NMU标准品的HPLC(惠普1090M)-电喷雾离子化接口(electrospray ionizing, ESI)-MS(惠普5989A四极质谱仪)检测方法。色谱条件：进样量2 μl， Zorbax C18分析柱(150 mm，2.1 mm内径)，纯乙腈(光谱纯)流动相(0.3 ml·min^－1)；雾化和质谱工作条件：喷雾气压(氮气)550kPa、干燥气体(氮气)10 L·min^－1、干燥气体温度100℃、阳离子采集模式、CID 150V、扫描范围50～200m/z（误差±0.1）。然后将60 ml NFS色谱制备组份浓缩至干，再用0.6 ml流动相溶解，在上述条件下分离测定样品的102m/z离子色谱和保留时间及其质谱。NMU的检出限(以145 m/z单离子采集方式计算)为100 ng。

1.6液相色谱－紫外光谱测定

以添加NMU标准品的未亚硝化鱼露色谱制备组份为对照，水/乙腈(体积比1∶1)为流动相(0.4 ml·min^－1)，用Zorbax C18分析柱对NFS色谱制备组份的浓缩物进行HPLC (HP1090M)再分离（进样量1 μl），以二极管阵列紫外检测器测定色谱图和紫外吸收光谱。

2结果

2.1NFS中NAD的HPLC分离测定和制备

当用PRP-1分析柱对NFS纯化萃取物中的NAD，进行HPLC-PHPS-TEA法分离测定时，在与NMU标准品保留时间相同处(12 min)，可见一明显的色谱峰，含量为19.8 μmol·L^－1(图1-a、b)；未经亚硝化的鱼露样品中检测不到此峰。在不进行柱后光水解的条件下，该色谱组份（下称可疑NMU）与NMU标准品一样不能检出(图1-c)。

在用PRP-1半制备柱进行HPLPC-HPS-TEA检测时，发现NFS中可疑NMU峰的保留时间变为13.5 min。由于PHPS-TEA检测器会完全破坏待测化合物，必需直接从色谱柱后收集含可疑NMU峰的流动相。在PHPS-TEA检测器内色谱组份的保留时间为1.5 min，故在柱后收集从保留时间11 min到13 min的流动相。

2.2NFS可疑NMU峰制备组份与NMU标准品的质谱比较

以Zorbax C18分析柱，纯乙腈为流动相，进行HPLC-ESI-MS分离检测，发现在145分子离子色谱图中NFS可疑NMU制备物和NMU标准品的保留时间相似，分别为1.89 min和1.86 min；在50～200 m/z的扫描范围内，NFS可疑NMU制备物和NMU色谱峰的质谱特征峰均为64、102、145 m/z（图2）。

a， from NMU (40 ng)-spiked nitrosated fish sauce with photohydrolysis; b， from nitrosated fish sauce with photohydrolysis; c， nitrosated fish sauce without photohydrolysis.

图1亚硝化鱼露萃取物PRP-1分析柱的

HPLC-PHPS-TEA分离测定色谱图

Figure 1Chromatograms obtained by HPLC-PHPS-TEA

from nitrosated fish sauce

2.3NFS可疑NMU组份与MNU标准品的紫外吸收光谱比较（图3、4）

以Zorbax C18为分析柱，体积分数为50%的乙腈为流动相，对NFS可疑NMU制备物进行HPLC再分离和二极管阵列紫外检测器检测，发现该可疑NMU制备物可分为2个峰，均为溶剂峰的拖尾峰，保留时间分别为1.55 min和1.69 min，前者的最大吸收峰（λ_max）为230 nm，后者为199 nm。添加NMU标准品的未亚硝化鱼露样品制备物只有一个与溶剂峰完全分离的色谱峰，保留时间为1.55 min，其λ_max