摘要目的：研究甜菜碱对大鼠肝细胞膜表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）受体及其酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase，TPK）活性的影响。方法：应用受体的放射配基结合分析法（radioligand binding assay of receptors，RBA），比较实验组和对照组之间¹²⁵I-EGF与其受体的结合情况；受体酪氨酸蛋白激酶活性测定法，以大鼠肝细胞膜可溶性蛋白为酪氨酸蛋白激酶来源，比较实验组和阴性组之间受体蛋白自身磷酸化作用的差异。结果：26 nmol·L^－1～5.2 mmol·L^－1的甜菜碱均能抑制正常大鼠肝细胞膜EGF受体与其配基的结合，这种抑制作用为非竞争性抑制；10与100μmol·L^－1的甜菜碱可激活酪氨酸蛋白激酶活性，而10mmol·L^－1的甜菜碱则抑制酪氨酸蛋白激酶活性。结论：甜菜碱可以抑制EGF受体与其配基的结合并影响EGF受体的酪氨酸蛋白激酶活性。

中国图书资料分类法分类号Q26

The effect of betaine on epidermal growth factor receptor

and tyrosine protein kinase of rat liver cell membrane

QIU Yang, HUANG Li-Xin, HE Shi-Peng

(Department of Biophysics, Beijing Medical University, Beijing100083)

ABSTRACTObjective: To study the effect of betaine on EGF receptor and its tyrosine protein kinase activity of rat liver cell membrane.Methods: Radioligand binding assay of receptor, comparing the binding of¹²⁵I-EGF to its receptor between test groups and the control group; Receptor tyrosine protein kinase activity test, using the soluble proteins of rat liver cell membrane as the source of tyrosine protein kinase to compare the autophosphorylation difference between test groups and the negative group.Results: 26 nmol· L^－1～5.2mmol·L^－1 betaine inhibited the binding of EGF receptor with EGF in a noncompetitive way, 10, 100μmol·L^－1 betaine stimulated TPK activity, but inhibited TPK activity when concentration was up to 10mmol·L^－1.Conclusion: Betaine can inhibit the binding of EGF receptor with EGF and affect TPK activity conspicuously.

MeSHBetaine/pharmacolProtein-tyrosine kinase/drug effReceptors, epidermal growth factor

甜菜碱(betaine)也称为N-三甲基甘氨酸，是一个小分子的季胺，通常以盐酸盐的形式存在，临床上用作利胆剂。近年来，陆续发现甜菜碱还具有多种药理作用：可以取代山梨醇保护体外培养的肾髓质细胞抵抗高渗^［1］；调节多种细胞对高渗的反应，大大缓解或消除由于高渗导致的DNA复制、蛋白质合成及细胞增殖速率的下降^［2］， 并且抑制高渗介质诱导的HSP70基因的表达^［3］。不仅如此，甜菜碱还可抑制L1210白血病细胞、肉瘤37及埃利希瘤等肿瘤细胞株的有丝分裂，当和维生素C的同分异构体D-异抗坏血酸联合作用时，这种抑制作用更为显著^［4］。另外，甜菜碱还是一种甲基化试剂，可被细胞吸收并参与细胞内的甲基转移过程^［5］。甜菜碱虽然具有多种引人注目的生理活性，但其作用机制仍不明确。我们在研究中药枸杞的生物学活性时曾发现，枸杞的10%(体积分数)乙醇提取液能与表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)受体结合, 经分析鉴定，该提取液富含甜菜碱。为了进一步探明甜菜碱的作用机制，我们选择EGF受体及EGF受体酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase, TPK)为研究对象，在离体条件下，考察甜菜碱对上述两者的作用，获得了有关甜菜碱作用机制的初步证据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

成年Wistar大鼠，体重250 g左右，由我校实验动物中心提供。甜菜碱、小鼠EGF（受体纯）、ATP购自Sigma公司；Na¹²⁵I（3.7×10⁷Bq·ml^－1）购自中国原子能研究所；［γ-³²P］ATP(3.7×10⁷Bq^.ml^－1) 购自北京市亚辉生物医学工程公司；细胞膜制备液：50ml 0.2mol·L^－1 Tris-HCl, 50ml 4mmol·L^－1 EDTA, 50ml 4mmol·L^－1 EGTA,17.5g蔗糖混合加蒸馏水至200ml即成；HEPES缓冲液：95.3mg HEPES、2.51mg MnCl₂、6.5mg BSA溶于5ml蒸馏水中,4 ℃保存；ATP反应液： 临用前将0.1ml ATP(50mg·L^－1)和0.1ml［γ-³²P］ATP(1.85×10⁶Bq·ml^－1)混合，再加0.4ml HEPES缓冲液即得；闪烁液：500ml二甲苯中溶解2.5gPPO、0.25gPOPOP,避光保存。

1.2方法

大鼠肝细胞膜EGF受体及可溶性EGF受体蛋白的制备： 大鼠断颈取血后，立即取肝，用生理盐水快速清洗，剪碎。加10倍量膜制备液，用内切式匀浆机匀浆3次，每次1 min，再用玻璃匀浆器匀浆3 min。匀浆液于4 ℃、2 500 r·min^－1离心10 min,弃沉淀；上清液于4 ℃、5 000 r·min^－1离心30 min，弃沉淀；取上清液于4 ℃、13 000 r·min^－1离心60 min，弃上清；沉淀用不加蔗糖的膜制备液吹打使其悬浮后,再于4 ℃、13 000 r·min^－1离心60 min，弃上清，沉淀分成2份，其中1份用不含蔗糖的膜制备液吹打使其悬浮,得大鼠肝细胞膜制剂，按每管1 ml分装,－70℃贮存。使用前稀释成一定浓度后即可用于EGF受体结合抑制实验。另一部分沉淀用20mmol·L^－1、pH7.4的Tris-HCl(含有体积分数分别为1%、10%的Triton X-100和甘油)溶液吹打使其悬浮，室温放置20 min后，于4℃、38000r·min^－1离心60 min，上清液中即含有可溶性EGF受体，将上清液按每管1ml分装，－70℃贮存，临用前稀释成适当浓度。

受体蛋白含量测定：用考马斯亮蓝比色法测定。吸取蛋白提取液0.3 ml，加入等量的2 mol·L^－1 NaOH溶液，于70℃水浴保温30 min使溶液变为清亮，加入2.4ml蒸馏水，取0.1ml溶液进行比色。

¹²⁵I-EGF的制备及其放射性比活度的测定：按Iodogen固相氧化法制备¹²⁵I-EGF，放射性比活度的测定采用放射受体自身替代法，方法详见文献［6］。放射性比活度为8.64×10¹³ Bq·mmol^－1。

EGF受体的结合抑制实验：0.4 ml EGF受体反应缓冲液［50 mmol·L^－1、pH7.4 Tris-HCl,1mmol·L^－1 EDTA,1mmol·L^－1 EGTA,1%(体积分数)BSA］中含50μg肝细胞膜蛋白，625Bq¹²⁵I-EGF,甜菜碱的浓度在26nmol·L^－1到5.2mmol·L^－1之间。加甜菜碱的为实验组，不加甜菜碱的为对照组，非特异结合管(non-specific binding, NSB)中加入1μgEGF。每一样品设3个平行管。反应液于25℃保温60 min，保温结束后将试管置冰水浴中终止反应，用细胞收集器将反应液迅速抽滤到玻璃纤维滤膜上［0.1%(体积分数)BSA预饱和］,用0.05mol·L^－1 pH 7.4的PBS15ml冲洗滤膜(3×5ml),除去游离的¹²⁵I-EGF,用γ-计数仪测量各滤膜上的每分放射性计数（f/min^－1),求出各样品的均值,按下式计算结合抑制率(%):

［1－(f_实验组－f_NSB)/(f_对照组-f_NSB)］×100%

EGF受体结合反应的动力学实验：分A、B两组同时进行。A组：0.4 ml反应缓冲液［50 mmol·L^－1、pH7.4 Tris-HCl,1mmol·L^－1 EDTA,1mmol·L^－1 EGTA,1%(体积分数)BSA］中含50μg肝细胞膜蛋白，625Bq¹²⁵I-EGF以及不同量的EGF(0.03ng～3.2ng), 每个样品设3个平行管。B组： 0.4ml 反应缓冲液中含 50μg 肝细胞膜蛋白， 625Bq¹²⁵Ⅰ-EGF、2mmol·L^－1甜菜碱。每一样品设3个平行管，同时设空白组和非特异组（NSB），加样完毕后的反应和测量过程与EGF受体的结合抑制实验相同。实验结果用双倒数作图法进行处理，求出甜菜碱对EGF受体的结合抑制常数Ki(mmol·L^－1)。

EGF受体的酪氨酸蛋白激酶活性测定：70μl反应液中含20μlHEPES缓冲液、25μl可溶性肝细胞膜受体蛋白(100mg·L^－1)及不同浓度的甜菜碱。空白组不加甜菜碱和可溶性肝细胞膜蛋白，用20mmol·L^－1、pH7.4 Tris-HCl(含有体积分数分别为1%、10%的Triton X-100和甘油)补足反应液体积；阳性组加入100 ng EGF；阴性组不加EGF。加样完毕后反应液置于25 ℃保温10 min，再置于0℃保温10 min后，加入30μlATP反应液（含2.78×10⁴Bq［γ-³²P］ATP和0.75μgATP）,准确反应5 min，随即加入20μl、5mol·L^－1 HCl终止磷酸化反应。将反应液抽滤到Whatman 3#滤纸上,依次用0.01mol·L^－1焦磷酸钠(含100 g·L^－1 T