摘要目的：研究转化生长因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）在颞下颌关节紊乱病病因及发病机制中的作用。方法：采用夹心法酶联免疫吸附测定法对31侧颞下颌关节紊乱病患者及7侧健康志愿者的关节液进行了TGF-β1的检测。结果：7侧健康志愿者关节的关节液中未能检测到TGF-β1的存在。结构紊乱类14侧中只有4侧呈阳性结果，而骨关节病类17侧中有16侧检测到TGF-β1的存在，二者的差异具有显著性。健康志愿者的关节液中TGF-β1水平与颞下颌关节紊乱病患者关节液TGF-β1水平差异也呈显著性。结论：TGF-β1在颞下颌关节紊乱病尤其是骨关节病类的病因及发病机制中可能起着重要作用。

中国图书资料分类法分类号R782.6

Detection of transforming growth factor-β1 in the synovial fluid

of patients with temporomandibular disorders

FANG Ping-Ke^#, MA Xu-Chen, MA Da-Long, ZHANG Zhen-Kang, FU Kai-Yuan

(#Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing100081)

ABSTRACTObjective： To examine the presence of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in the synovial fluid (SF) of patients with temporomandibular disorders (TMD).Methods：The synovial fluid samples were obtained from 14 temporomandibular joints (TMJ) of 12 patients with TMJ internal derangement (ID) and 17 TMJ of 15 patients with TMJ osteoarthrosis (OA). 7 synovial fluid samples of TMJ of 4 asymptomatic donors served as normal controls. The concentration of TGF-β1 was detected with the sensitive and specific sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (Sandwich-ELISA).Results： TGF-β1 could not be detected in 7 normal controls, whereas the TGF-β1 concentration in SF of patients with ID and OA was detectable. The level of TGF-β1 in TMD SF was significantly different from those of normal controls. Although 16 out of 17 samples of OA had the detectable level, only 4 out of 14 samples of ID displayed detectable level of TGF-β1. The TGF-β1 level of SF of patients with ID and those of OA were significantly different.Conclusion： These results demonstrate that TGF-β1 probably plays an important role in the etiology and pathogenesis of osteoarthritis.

MeSHTemporomandibular joint diseasesOsteoarthritisSynovial fluid/chemTransforming growth factor/anal

转化生长因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）是TGF-β超家族的重要成员。在细胞外基质蛋白质表达方面，TGF-β1通过上调纤维连接蛋白、胶原（Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ、Ⅺ型）、蛋白多糖、肌腱蛋白、骨连接蛋白、骨桥蛋白、血小板反应蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor 1, PAI-1）及组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMP）的合成以及下调胶原酶、基质溶素、纤溶酶原激活物（plasminogen activator, PA）的合成来增加细胞外基质的合成^［1～3］。

为研究TGF-β1在颞下颌关节紊乱病病因及发病机制中的作用，本研究采用了高敏感度、高特异性的夹心法酶联免疫吸附测定（Sandwich-ELISA)测量了TGF-β1在颞下颌关节骨关节病（temporomandibular joint osteoarthrosis, TMJ OA）滑液（synovial fluid, SF）中的存在，并探讨TGF-β1与骨关节病中骨质改变的关系。

1材料与方法

1.1收集关节液

31侧颞下颌关节紊乱病的SF取自我院颞下颌关节病诊治中心进行关节造影及关节镜手术的27例患者，7侧对照组关节液取自4名健康志愿者。疾病分类标准采用马绪臣等^［4］提出的分类方法。诊断依据临床检查及X线检查结果（包括髁突经咽侧位片、许勒位片及关节造影检查）。全部病例均行常规关节上腔穿刺，回吸无血，注入2ml无菌生理盐水，连续注入、冲洗、回吸3次，获得关节冲洗液1.0～1.8ml，离心（1000 r/min，30 min）后取上清，于－70 ℃冻存待测。

1.2激活TGF-β1

取样品40 μl放入0.5 ml的薄壁透明管中，加入40 μl 2.5 mol·L^－1乙酸与10 mol·L^－1尿素的混合液，混匀，室温下静置10 min，以便彻底激活TGF-β1。然后用40 μl含有2.7 mol·L^－1 NaOH的6 mol·L^－1 HEPES中和。最后每管中加入测定稀释液RD6M 360μl，混匀后待测。

1.3Sandwich-ELISA测定样品中TGF-β1浓度

实验操作严格按照Quantikine Human TGF-β1 Immunoassay Kit (R&D systems, Inc., minnea-polis, MN)操作程序进行：首先将标准品进行溶解并倍比稀释;然后将预备好的标准品、样品（38侧，其中含31侧患者样品，7侧健康对照样品）用8道移液器移入预先包被有TGF-β可溶性Ⅱ型受体的微孔板中，每孔200μl，每个标准品、样品设两个重复孔；用不含标准品及样品的测定稀释液RD6M作为零对照（两个重复孔）。室温下静置3 h，洗涤3次。然后，加200μl的酶标抗体（偶联辣根过氧化物酶的抗TGF-β1 多克隆抗体），室温下静置1.5 h，洗涤3次。再加200μl的底物溶液（过氧化氢和四甲基联苯胺），室温下静置20 min后加入50μl 1 mol·L^－1 H₂SO₄终止反应，30 min内用ELISA阅读计（Bio-Rad, Richmond, CA）测光密度D值（测定波长450 nm，参考波长570 nm）。试剂盒的最低检测质量浓度小于7ng·L^－1。

1.4结果分析

取各标准品、样品及零对照重复孔的D平均值，然后将标准品、样品的D平均值分别减去零对照的平均值，得出各标准品、样品的D值。以X轴表示质量浓度，Y轴表示D值，将标准品的X值及Y值描绘在图上，取其直线部分，求出回归方程。将各样品的D值代入回归方程，求出质量浓度值。再把该值乘以稀释倍数12，得出关节冲洗液原始质量浓度。所有数值均采用±s的表示方式；两组样本间比较采用Mann-Whitney U检验（Mann-Whitney U test）。

2结果

2.1临床资料

本研究的样品包括27例TMD患者31侧的SF及4名健康志愿者7侧的SF，共计31例38侧关节SF。其中结构紊乱类12例（14侧）：包括可复性关节盘前移位8例（9侧），年龄21～58岁，平均33.25岁；不可复性关节盘前移位4例（5侧），年龄17～45岁，平均26.25岁。X线片显示，所有结构紊乱类均无骨质改变。骨关节病类15例（17侧）：单纯关节盘穿孔者2例（3侧），年龄分别为59、21岁，无骨质破坏；有明确骨关节病改变者13例（14侧），年龄21～55岁，平均38岁，其中伴有关节盘穿孔者3例（3侧）；伴有结构紊乱者10例（11侧）。平片示骨质破坏吸收者3例（3侧），示骨质增生者10例（11侧）。健康志愿者的双侧关节无任何临床症状及体征。

2.2TGF-β1质量浓度测量

健康志愿者的滑液中不能检测到TGF-β1的存在，TMD患者关节液中TGF-β1的平均水平为(100±109) ng·L^－1。TMD患者关节液的TGF-β1水平与健康志愿者滑液中TGF-β1水平之间的差异具有显著性（P＜0.01）。图1显示了TGF-β1在TMJ结构紊乱及骨关节病患者滑液中的质量浓度变化。颞下颌关节结构紊乱患者的TGF-β1水平为（48±88） ng·L^－1（n=14），颞下颌关节骨关节病患者的TGF-β1水平为(144±108) ng/L^－1 （n=17）；两者的差异具有显著性（P＜0.01）。

3讨论

在本研究中，我们首次检测了颞下颌关节病患者滑液中TGF-β1表达情况。

图1TMJ结构紊乱和骨关节病患者滑液TGF-β1的浓度

Figure 1The TGF-β1 levels in the SF of individual

patients with TMJ ID and OA

TGF-β对多种细胞类型都具有很强的增殖、分化、粘附等方面的调节效应。近年来的研究表明，TGF-β的生物学效应主要取决于下面的各个环节：（1）配体的存在形式，如是活性形式的或是潜在活性形式的TGF-β；(2）TGF-β受体的表达情况。在已知的Ⅰ-Ⅸ种类型受体中，Ⅰ和Ⅱ型是研究得最多而且最为透彻的两类受体，二者均为跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶，在TGF-β的信号传导中起着不可缺少的作用。该信号传导系统不同于已经发现的其它任何一种信号传导系统^［5］；（3）SMADs及其它下游的信号传导分子^［6～8］。这些分子的过度表达、表达不足或突变均可导致许多细胞的恶性转化^［5～9］。尽<