摘要目的：提高放射免疫显像(radioimmunoimaging, RII)质量, 建立卵巢癌预定位放射显像技术。方法：将合成的环二乙基三胺五乙酸(cyclic diethylenetriamine pentaacetic acid, cDTPA)与卵巢癌单抗COC183B₂进行偶联，Sephadex分离纯化后，采用免疫组织化学染色及细胞放射自显影对偶联物进行活性测定。将偶联的COC183B₂-cDTPA或 IgG分别经腹腔注入荷人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型体内，48 h后，将还原^99mTc淋洗液经腹腔注入体内，6 h后进行RII。显像后，体外称重并测量瘤及其他正常组织放射性活性，计算瘤与非瘤放射性比值（T/NT）。结果：(1) COC183B₂-cDTPA与浆液性卵巢癌组织免疫组化染色呈阳性；细胞放射自显影结果可见卵巢癌SKOV₃细胞膜周围呈环状显影，提示偶联后单抗仍保留了较好的免疫活性。（2） 注射还原^99mTc 6 h后RII, 可见实验组荷瘤裸鼠腹腔有特异放射性聚集；而对照荷瘤裸鼠腹腔无特异放射性聚集。实验组各器官T/NT值高于对照组，两者差异有显著性(P＜0.05)。结论：cDTPA偶联COC183B₂单抗进行卵巢癌预定位放射免疫显像简单、可行，有望应用于临床。

中国图书资料分类法分类号R737.31

The preliminary clinical study of pretargeted

radio-immunoimaging in ovarian carcinoma

LI Xiao-Ping^＃,FENG Jie,QIAN He-Nian, FU Tian-Yun,PENG Yan, ZHU Dian-Qing， et al

(#Gynecologic Oncology Center, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing100044)

ABSTRACTObjective: To establish the pretargeted radioimmunoimaging(RII) technique for improving the quality of RII in ovarian carcinoma.Methods: Monoclonal antibody COC183B₂ was conjugated with cyclic DTPA (cyclic diethylenetriamine pentaacetic acid) DTPA anhydride and its immunoactivity was measured by PAP staining or autoradiography in vitro. COC183B₂-cDTPA or normal mouse IgG (NMIgG) were respectively injected intraperitoneally (i.p.) into two groups of nude mice bearing human ovarian carcinoma with ascites.48 hours later, reduced^99mTc was injected i.p. again. RII was performed 6 hours later. After RII, the γ counting of related tissues was measured to calculate the ratio of radioactivity for tumor and non-tumor (T/NT).Results: (1) The coupled COC183B₂showed good immunoactivity by PAP staining and autoradiography.(2) 6 hours after

^99mTc administration, RII showed clear localization of tumor and T/NT ratios were significantly higher than those of the control group.Conclusion: Monoclonal antibody COC183B₂ coupled by cDTPA used for pretargeted RII is practical, hopefully to be used clinically in ovarian carcinoma.

MeSHOvarian neoplasms/radionuclideIsotope labeling/methodsAntibodies, monoclonal

近年来随着核技术的改进及显像技术的发展，采用单克隆抗体进行放射免疫显像为卵巢癌诊断开辟了新途径，但仍存在许多亟待解决的问题，限制了该技术的临床应用。预定位技术的原理即将抗体先注入体内同肿瘤结合，待体内未结合的抗体排出体外，再注入放射性核素，可提高T/NT值，减低本底，同时简化标记。有关卵巢癌预定位放射免疫显像的报道国内、外较少，本研究旨在为临床应用提供基础。

1材料与方法

1.1环二乙基三胺五乙酸酐(cDTPA)的制备

取二乙基三胺五乙酸粉末(DTPA, Sigma公司)400 mg,乙酸酐0.8 ml,吡啶0.5 ml, 放入棕色瓶内进行反应，66～67℃反应24 h，所得的白色粉末即为cDTPA^［1］。

1.2抗卵巢癌单抗COC183B₂与cDTPA的偶联、分离及纯化

取COC183B₂(10 g·L^－1)0.5ml^［2］, cDTPA、DMSO(二甲基亚砜) 20μl(10g·L^－1),缓冲液为NaHCO₃(pH 8.2),反应24～26 h，得抗体与DTPA偶联物。采用SephadexG75柱对COC183B₂-cDTPA进行分离，淋洗液为PBS0.2mol·L^－1(含0.5mol·L^－1 NaCl)。收集各管洗脱液，并用紫外线核酸蛋白检测仪(波长280nm)测定其蛋白含量，绘出淋洗曲线，首峰即COC183B₂-cDTPA 蛋白峰。采用免疫组织化学染色(PAP法)进行偶联单抗的活性测定。

1.3细胞放射免疫自显影

将培养的卵巢癌细胞SKOV₃(ATCC) 进行分离，调细胞浓度为1×10⁷ml^－1，取COC183B₂-cDTPA(1 g·L^－1) 0.01mg与还原的^99mTc (7.4×10⁸Bq·ml^－1) 3.7×10⁶ Bq 在室温下混合,37℃保温120 min后，生理盐水冲洗3次，将细胞吹散，滴加在滤纸上，覆盖一层保鲜膜。在暗室中压X光胶片，－20℃曝光48 h后读片。

1.4荷人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型的建立^［3］

取卵巢癌细胞株SKOV₃,调节细胞浓度1×10⁷ml^－1,注入雌性、4～6周BALB/c裸鼠皮下形成皮丘。每只裸鼠注射2～4点，每点6×10⁶个细胞。待皮下移植瘤直径约为0.5～1.0cm后，再次将已形成的皮下瘤剪成1mm³块注入裸鼠腹腔。待腹腔触摸到大小不等的瘤结节时备用。

1.5预定位放射免疫显像

将腹水瘤裸鼠随机分为2组，每组3只。分别经腹腔注入COC183B₂-cDTPA 或正常鼠IgG（每只0.25 mg）进行预定位，48 h后,经腹腔注入还原的^99mTc 2.59×10⁷ Bq (7.4×10⁸Bq·ml^－1)。6 h后采用Sophy NXT γ照相机及通用型平行孔准直器进行显像。显像后即刻处死荷瘤鼠，依次取下肝、脾、肠、肌肉及肿瘤称重并用井型探测仪进行放射性计数，计算单位重量放射性计数(cpm)及T/NT值。

1.6数据处理及统计分析

计量资料采用t检验以±s表示。

2结果

2.1COC183B₂-cDTPA偶联物免疫组化染色及细胞放射自显影

偶联物COC183B₂-cDTPA与浆液性卵巢癌组织免疫组化染色呈阳性结果，卵巢癌细胞膜呈棕色；细胞放射自显影结果可见卵巢癌SKOV₃细胞膜周围呈环状显影，提示COC183B₂与cDTPA偶联后，保留了较强的与卵巢癌细胞结合的活性，显示该偶联单抗用^99mTc标记后仍保留了较好的免疫活性。

2.2预定位放射免疫显像

注射^99mTc 6 h后, SPECT扫描显示实验组荷瘤裸鼠腹腔有特异放射性聚集，且放射性本底较低；而对照荷瘤裸鼠腹腔无特异放射性聚集。显像后井型探测仪测定各器官的T/NT值见表1，由表1可见T/NT值实验组明显高于对照组，两者差异有显著性(P＜0.05)。

表1显像后两组荷瘤鼠各器官T/NT值(±s)

Table 1T/NT value of two groups of nude mice after RII(±s)

Liver Spleen Muscle Small

intestine COC183B₂ 4.0±1.8^* 3.0±1.7^* 19.3±1.2^* 5.2±3.2^* IgG 0.2±0.1 1.2±0.8 1.9±0.6 1.1±0.2

*P＜0.05,compared with control value．

3讨论

近年来随着高亲和力的单抗制备及标记技术的改进，放射免疫显像已成为热门的研究课题。卵巢癌RII始于80年代，其敏感性高，特别是对盆腔内肿瘤的诊断优于B超、CT及MRI。但仍存在许多亟待解决的问题，如T/NT值低，本底高，标记操作繁琐等。临床应用中为减少本底，提高图像清晰度和探测效率，有不少方法如相减术、脂质体、第二抗体和标记片段等被采用，但效果并不令人满意。此外药代动力学研究还表明标记的抗体在肿瘤及正常组织内清除较慢，不利于短半衰期核素的应用。但是^99mTc具有良好的物理性能(T_1/2=6h,E=140keV),如何更好应用到RII是值得研究的问题。

预定位放射免疫显像技术是首先将特异的已与金属螯合物cDTPA偶联<