摘要目的：研究小鼠脾细胞DNA修复能力的增龄变化以及这种变化的发生与损伤可诱导的gadd45、gadd153基因表达的关联。方法：以紫外线损伤脾细胞DNA，用非程序DNA合成和单细胞凝胶电泳试验测定DNA修复能力；用Northern 杂交方法检测紫外线损伤后gadd45、gadd153基因转录水平的变化。结果：老年小鼠脾细胞DNA修复能力低于青年鼠，老年鼠gadd45 和gadd153基因的紫外线损伤的可诱导性也低于青年鼠。结论：小鼠脾细胞DNA修复能力随增龄而下降，这种变化的发生可能与老年小鼠脾细胞在紫外线损伤后gadd45、gadd153 mRNA表达的可诱导性下降有关。

中国图书资料分类法分类号Q344-332

The change of DNA repair capacity and gadd45,

gadd153 gene inducibility in old mouse splenocytes

YAN Xue-Dong, ZHANG Zong-Yu, TONG Tan-Jun

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Beijing Medical University, Beijing100083)

ABSTRACTObjective: To investigate the change of DNA repair capacity of mouse splenocytes with age and the correlation between this change and the mRNA expression of DNA damage inducible genes gadd45, and gadd153.Methods: The mouse splenocytes were irradiated by UV light, then unscheduled DNA synthesis(UDS) and single cell gel electrophoresis were performed to measure DNA repair capacity, and mRNA expressions of gadd45, and gadd153 were studied by Northern blot analysis.Results: DNA repair capacity of old splenocytes was much lower than that of young ones. After UV irradiation, the mRNA expressions of gadd45 and gadd153 increased obviously in both the young and the old splenocytes. But the increase was significantly higher in the young than in the old.Conclusion: There is a decline in DNA repair capability in mouse splenocytes with age. This may be partly due to a relatively lower mRNA expressons of gadd45, and gadd153 genes in old splenocytes after UV irradiation.

MeSHDNA repairGadd45 genes^☆Gadd153 genes^☆SpleenGene expressionTranscription, genetic

近年来，有关DNA损伤修复和衰老关系的研究日益引起人们的关注。DNA作为遗传信息的携带者和传递者，其结构与功能稳定的重要性不言而喻。然而，生物体中的DNA在内、外环境中各种物理、化学因素的影响下不断发生损伤，因此DNA损伤的修复对维持细胞的正常功能就显得尤为重要。许多研究表明DNA修复能力随增龄而下降^［1，2］，另外，有研究表明DNA损伤可诱导约20个生长阻滞与DNA损伤可诱导基因（growth arrest and DNA damage inducible gene, gadd）的表达^［3］。为了解衰老过程中DNA修复能力下降的可能分子机制，本实验以体外培养的小鼠脾细胞为材料，以紫外线照射为DNA损伤剂，观察其修复能力随增龄的变化，以及DNA损伤后gadd基因族中gadd45、gadd153 mRNA 表达随增龄的变化。

1材料与方法

1.1材料与试剂

BALB/c纯种小鼠为本室自养，分青年鼠（3～6月龄）及老年鼠（28～32月龄）两个年龄组,雌雄不拘；HB101为本室保存菌种；pBlueSK 质粒(含有gadd153，gadd45 cDNA)由北京医科大学人民医院惠赠；β-actin cDNA 探针为本室留存。

细胞培养基RPMI-1640为GIBCO/BRL公司产品；胎牛血清为北京北郊农场血液制品所产品；刀豆球蛋白A (ConA)、甲磺酸甲酯(methyl methanesulfonate, MMS) 、羟基脲、低熔点琼脂糖、十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl) 及碘化丙啶(propidium iodide)均为美国Sigma公司产品；Triton-X100 购自BIB；³H-TdR 购自中国原子能科学研究所; α-³²P-dCTP（3.7×10⁵Bq·μl^－1）购自北京亚辉生物工程公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯级。

1.2方法

脾细胞的制备及非程序DNA合成（unscheduled DNA synthesis, UDS）试验：参照文献［2］进行。

单细胞凝胶电泳试验^［4］：将不同年龄小鼠脾细胞用RPMI-1640稀释至1×10⁶ ml^－1，铺于平皿（60 mm）中，然后进行紫外线照射（同UDS试验，紫外灯的波长为254 nm，照射强度为0.45 J·m^－2.s^－1，时间5min）以损伤DNA。损伤后加入培养液于37℃培养一定时间，收集对照组(未经损伤处理)及损伤处理后0，0.5，1，3，6，12h的脾细胞，制成单细胞悬液，调整为2×10⁵ml^－1。然后进行单细胞凝胶电泳试验。进行结果分析时，每组随机选取至少20个细胞，在荧光显微镜下用目镜测微尺测量DNA迁移距离（migration distance of DNA，MDD），即从彗星头部中心到尾尖的距离。以DNA迁移距离代表链断裂的程度。

Northern 印迹杂交：gadd45 cDNA探针应用kpnⅠ和sacⅠ内切酶,gadd153 cDNA探针应用BamHⅠ内切酶消化pBlueSK质粒后制备。随机引物法，α-³²p-dCTP标记探针。培养皿内脾细胞经紫外线照射（处理同上）5min后，加入混合培养液于37℃保温6h，冰冷PBS缓冲液洗涤细胞两次，应用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，RNA经甲醛变性凝胶后转移至硝酸纤维素膜上，然后分别用α-³²p-dCTP标记的gadd153、gadd45 cDNA和β-actin cDNA探针与固定在硝酸纤维素膜上的RNA进行预杂交及杂交，按常规方法洗膜，于－70℃放射自显影。用图像分析仪测定杂交信号的光密度值。

2结果

2.1小鼠脾细胞DNA修复能力随增龄而下降

羟基脲能有效地抑制DNA的复制，当浓度适当时，对修复合成的抑制则较小。本实验培养液中加入5 mmol·L^－1羟基脲，经损伤诱导后细胞的DNA合成即可代表DNA的修复合成即UDS。从图1可见，在紫外线照射后12h左右DNA合成达峰值；老年鼠脾细胞对UV照射所致损伤的修复能力明显低于青年鼠，经t检验差异有显著性，P＜0.01。

图1不同年龄小鼠脾细胞DNA修复合成能力的比较

Figure 1A comparison of UV-initiated UDS(³H-TdR incorporation)

in splenocytes of young and old BALB/c mice

单细胞凝胶电泳技术（single cell gel electrophoresis assay，SCGE），又称彗星试验（comet assay），是一种在单细胞水平检测DNA损伤与修复的方法。通过凝胶电泳，DNA从阴极向阳极方向迁移，断裂的DNA片段迁移速度快，在荧光显微镜下观察形成类似“彗星”的图象，在镜下用目镜测微尺直接测量DNA迁移距离（从彗星头部中心到尾尖的距离）可判断DNA链断裂情况。紫外线照射所致的DNA损伤主要是形成环丁烷嘧啶二聚体和（6,4）光产物，并不形成单细胞凝胶电泳技术可直接检测的链断裂损伤，但细胞对其DNA损伤进行切除修复时，在内切步骤可形成链断裂，然后进行修复，断裂的链重接，因此可检测到的链断裂水平反映了内切和重接步骤的平衡。从图2及附表1可见，未受紫外线照射的青年鼠脾细胞没有DNA断裂，所以无彗尾，紫外线照射后，随着修复的进行，彗尾伴随着链断裂而出现，随着链重接而消失；老年鼠脾细胞未受紫外线照射前即有DNA断裂，紫外线照射后，于37 ℃孵育一定时间，老年鼠脾细胞的彗尾变长，但老年鼠DNA迁移距离平均值（mean value of migration distance of DNA， MV-MDD）的增加比青年鼠小，提示老年鼠脾细胞修复能力低于青年鼠，鲜有切口形成。

a, comet image of untreated splenocytes (young mouse); b, comet image of splenocytes at 1 h after UV irradiation (young mouse); c, comet image of untreated splenocytes (old mouse); d, comet image of splenocytes at 1 h after UV irradiation (old mouse).

图2显示DNA迁移的荧光显微摄影图像

Figure 2Fluorescence photomicrographs showing DNA migration patterns

表1紫外照射后以MV-MDD表示的链断裂形成

和持续的时间进程

Table 1Time course of strand break formation and persistence

as indicated by MV-MDD after UV irradiationl/μm

t/min 0 30 60 180 360 720