摘要目的：观察肌肉介导心钠素(atrial natriuretic factor, ANF)基因转移对肾性高血压大鼠的治疗作用。方法：利用基因克隆技术克隆和构建了高表达效率的人ANF cDNA基因真核表达质粒，应用肌肉缝线法将质粒转移到大鼠骨骼肌中。结果：ANF基因可以在骨骼肌中表达，并可释放入血，明显降低肾性高血压大鼠的血压，并产生利钠利尿效应，其作用可维持4～6周。结论：应用基因缝线进行肌肉介导的基因转移，可在肌肉内有效表达效应蛋白质，且可释放入血，产生药物治疗效果。

中国图书资料分类法分类号R544.1-332

Effects of muscle-mediated atrial natriuretic factor

gene transfer on renal hypertensive rats

gene transfer on renal hypertensive rats

QIN Yang-Jun, ZHANG Ji-Feng, ZHANG Chen-Hui, CHEN Guang-Hui, TANG Jian

(Institute of Cardiovascular Basic Research, Beijing Medical University, Beijing100083)

ABSTRCTObjective: To investigate the therapeutic effects of skeletal muscle-mediated atrial natriuretic factor (ANF) gene transfer on renal hypertensive rats.Methods: High efficient plasmid eukaryotic expressing vectors of ANF cDNA gene was constructed (pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF). And, in vivo ANF gene delivery was performed by the method of intramuscular gene suture in renal hypertensive rats.Results: The effects of ANF gene transfer on blood pressure and renal sodium and water excretion were studied in renal hypertensive rats. That the ANF constructs produced a marked decrease of mean arterial pressure (MAP) and a significant increase of urine volume and urinary sodium excretion on hANF construct received animals due to the local expression of ANF and its secretion into plasma. These effects could sustain for 4-6 weeks.Conclusion: Intramuscular gene transfer by gene suture method permitted highly efficient gene transfer efficiency, which could manufacture and secrete significant level of protein. Therefore, it might be a promising gene therapy method for providing therapeutic protein in circulation.

MeSHHypertension, renal/therAtrial natriuretic factor/ther useGene therapyMuscle

Gene transfer

心钠素（atrial natriuretic factor, ANF）是主要由心房肌细胞分泌的一种循环激素，具有强大的利钠、利尿，舒张血管和降低血压的作用^［1］。大量基础及临床资料证明，静脉滴注ANF可治疗原发性和某些继发性高血压^［2］，但由于ANF半衰期短，人工合成或基因工程生产成本高，使ANF的临床应用受到限制。利用肌肉转基因的方法将外源基因导入动物体内，使其在肌肉中持续表达蛋白质，并分泌到血液中，可有效克服蛋白质替代治疗血浆半衰期短的缺点，具有诱人的应用前景。本实验构建高效ANF真核表达载体，通过肌肉再生和缝线法提高外源基因在肌肉内的表达效率，探讨ANF基因治疗肾性高血压的可行性。

1材料与方法

1.1主要试剂

雄性Wistar大鼠由北京医科大学实验动物中心提供。各种限制性内切酶、MMLV逆转录酶、T₄ DNA连接酶、碱性磷酸酶、质粒载体pCI和pAdVAntage^TM购自美国Promega公司。QIAEX×PCR回收纯化试剂盒购自美国QIAGEN公司。丁哌卡因、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsalfonyl-fluoride, PMSF)和Aprotinin购自美国Sigma公司。人ANF放射免疫分析试剂盒购自中国原子能科学研究院。兔抗人心钠素抗体购自美国Peninsula Lab, INC。

1.2pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF的构建和鉴定

由pcDNA3/hANF亚克隆而来，构建过程见流程图(图1)，其中，pcDNA3/hANF由本室构建^［3］。将质粒转化感受态大肠杆菌，经筛选获得阳性转化菌，提取其质粒DNA进行酶切鉴定。

图1pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF构建流程

Figure 1The schematic illustration

of pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF construction

1.3质粒的大量提取和纯化

用大规模碱裂解法提取质粒，聚乙二醇纯化。DNA沉淀溶于去离子水中，根据260 nm、280 nm光吸收及琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定量和定性鉴定。

1.4外源ANF基因表达产物的检测

在健康雄性的Wistar大鼠股四头肌内转移200 μg的ANF表达质粒pcD₂/pAdVAntage^TM/ANF，7 d后切取该局部肌肉，提取肌肉组织总RNA和蛋白质,分别进行RT-PCR和Western blot实验。其中，PCR的上下游引物序列分别为5′-CCGGATCCATGAGCTCCTTCTCCACCAC-3′和5′-GGGAATTCTTATCTTCAGTACCGGAAGC-3′。

1.5肾性高血压大鼠模型的制备^［4］

选用4～5周龄，体重150 g左右雄性Wistar大鼠，术前禁食18 h，自由饮水。戊巴比妥钠（ip，45 mg/kg）麻醉后，打开腹腔，暴露肾脏。分离两侧肾动脉，把外径为0.3 mm的针灸针与血管长轴并置，并用手术丝线（000号）结扎，然后拔出针灸针,结果造成双侧肾动脉狭窄。术后予以皮下补水和注射卡那霉素，约4周形成高血压，平均动脉血压可达(187±15) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。

1.6肌肉转基因方法

大鼠形成高血压以后，利用肌肉介导的方法转移心钠素基因。在基因转移前3 d，沿肌纤维长轴方向注射丁哌卡因（0.4 ml, 50 g·L^－1水溶液），以引起肌肉再生。分别将1mg的pcD₂和pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF质粒DNA，制备成基因缝线,沿肌纤维长轴方向蜿蜒全部埋入标记的再生肌肉内。

1.7大鼠平均动脉血压（mean arterial pressure, MAP）和尿钠尿量测定

采用尾套法测定大鼠MAP。转基因以后第6天，用代谢笼收集大鼠24 h尿液，测定24 h尿量，并取1 ml尿液，室温6 000 r·min^－1离心10 min，取上清用火焰光度计法测定尿钠含量。

1.8血浆的ANF水平的测定

肾性高血压大鼠在转ANF基因第21天时，从尾静脉取血，以EDTA抗凝，分离血浆，用放射免疫分析法测定ANF水平。

1.9统计学处理

实验数据以±s表示，两组间的比较采用t检验。

2结果

2.1pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF的构建和鉴定

pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF的构建过程见图1。酶切鉴定图谱（图2）显示获得预期大小的片段，证明pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF构建正确。我们对pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF中插入的hANF cDNA序列测定结果还表明，应用RT－PCR克隆获得的hANF cDNA与Greenberg报道的编码人hANF核苷酸序列完全一致（结果未列）。

2.2外源ANF基因在肌肉中的表达

RT-PCR结果显示（图3），对照组肌肉未发现有ANF mRNA的转录，转ANF基因的肌肉则有明显的ANF mRNA的表达； Western印迹杂交的结果表明（图4），ANF真核表达质粒在肌纤维内表达生成了人ANF蛋白，存在的hANF蛋白质相对分子质量为14 000左右，可与抗ANF抗体特异结合，证明主要为hANF前体。

1, λDNA/Hind Ⅲ marker; 2, pcD₂ XbaⅠ/KpnⅠ cut; 3, pcDNA3/ANF XbaⅠ/KpnⅠ cut; 4, pAdVAntage^TM Sal Ⅰ cut; 5, pcD₂/ ANF Sal I cut; 6, pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF Kpn Ⅰ cut.

图2pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF的酶切鉴定

Figure 2Identification of pcD₂/pAdVAntage^TM/hANF

1, λDNA/Hind Ⅲ marker； 2, Water； 3