摘要目的：观察早期、晚期败血症大鼠肝细胞内核膜上1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-triphosphate receptors, IP₃R)的变化。方法：通过结扎并穿刺盲肠制作大鼠败血症模型，差速离心分离内核膜，［³H］IP₃放射配体分析肝内核膜IP₃R与其配体的最大结合容量（B_max）及亲和力(K_d)。⁴⁵Ca²⁺转运测定内核膜IP₃R释放Ca^2＋功能。结果：早期和晚期败血症B_max分别增加14%（P＜0.05）和91%（P＜0.01）。但K_d值无明显变化(P＞0.05)。IP₃引起⁴⁵Ca²⁺转运在败血症时也相应增加。结论：在败血症时肝细胞核被膜IP₃R发生上调，其释放Ca^2＋的能力增强, 但结构可能未发生变化。

中国图书资料分类法分类号R631.3-332

Changes of inositol 1,4,5-triphosphate receptors

in inner nuclear membrane of rat liver during sepsis

HAO Sheng-Li^＃, YANG Jun, ZHANG Sun-Xi, PANG Yong-Zheng, SU Jing-Yi, TANG Chao-Shu

(＃Department of Biophysics, Beijing Medical University, Beijing100083)

ABSTRACTObjective: To investigate the changes of inositol triphosphate receptors in the inner nuclear membrane of rat liver during sepsis.Methods: Septic rat model was prepared by cecal ligation and puncture (LCP). The binding site density (B_max) and affinity (K_d) of IP₃ to the inner nuclear membrane were measured by ［³H］IP₃ binding assay. The function of IP₃ receptors to release Ca^2＋ was assessed by⁴⁵Ca²⁺ movement to the inner nuclear membrane vesicle upon the action of IP₃.Results: B_max was increased by 14% (P＜0.05) during early sepsis and by 91%(P＜0.01) during late sepsis while no alterations of the affinity of IP₃R to its ligand was shown during sepsis.⁴⁵Ca²⁺ movement to the inner nuclear membrane vesicle was also increased accordingly during sepsis.Conclusion: Binding site density and the function of IP₃R in the inner nuclear membrane were progressively increased during sepsis, while there might be no change in the structure.

MeSHSepticemiaLiverCell nucleusInositol 1,4,5-triphosphateReceptors

败血症及继发的多器官功能衰竭是感染性死亡的常见原因^［1］。由于败血症的发病机制迄今尚未完全阐明，尽管目前医疗手段不断提高，病死率仍呈上升趋势^［1］。现已发现参与败血症的体液因子很多^［1］，研究这些因子在细胞水平上的相互作用是阐明败血症的关键。其中细胞核内Ca^2＋信号变化尤其值得关注。Ca^2＋是调节细胞功能代谢的重要信使物质，近来发现Ca^2＋不仅为胞浆信使，还是核内信使，参与调控细胞分裂、分化、凋亡、基因转录等核内重要过程^［2］。核存在一整套Ca^2＋信号产生系统^［2］：内、外两层核膜形成的腔（即内核膜腔）贮有大量的钙亦为一钙库，Ca^2＋-ATPase,和1,3,4,5-四磷酸肌醇受体（IP₄R）是核Ca^2＋ 摄取系统，分布于外层核膜上。1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5 triphosphate, IP₃) 受体(IP₃ receptor, IP₃R)和ryanodine受体（ryanodine receptor, RyR）是核Ca^2＋释放系统，分布在内核膜上，它们本身即为Ca^2＋通道, 分别在IP₃和环腺苷二磷酸核糖（cyclic ADP ribose, cADPr）作用下，将核被膜腔内贮存的Ca^2＋释入核浆。核Ca^2＋摄取和释放系统精确地调控核内［Ca^2＋］变化，进而影响核的各种功能^［2］。本室曾报道败血症大鼠肝细胞核Ca^2＋泵功能的改变^［3］，在此基础上本实验观察败血症大鼠肝细胞核内核膜IP₃R的变化。以探讨败血症时造成核Ca^2＋信号改变的机制。

1材料与方法

1.1大鼠败血症模型的制作^［4］

雄性SD大鼠200～250 g(北京医科大学实验动物中心提供），术前禁食8 h，自由饮水，异戊巴比妥钠（每1千克体重60 mg, i.p.）麻醉下，开腹，3-0号线结扎盲肠并用18号针头穿刺两孔，分层缝合腹壁。术后皮下注射生理盐水（每1千克体重40 ml）。术后9，18 h分别为早期败血症和晚期败血症。

1.2肝细胞核内核膜的提纯^［5］

所有操作在0～4℃下进行。用50ml冰冷TKM液（mmol·L^－1：Tris/HCl 50, KCl 25, MgCl₂ 5; pH 7.5）从门静脉原位灌洗肝，取肝剪碎置于40ml匀浆液(含0.25mol·L^－1蔗糖, 1.0mmol·L^－1 EGTA 的TKM液)中，匀浆，纱布过滤, 离心（2 250 r·min^－1, 10min）, 弃上清，将沉淀加6ml匀浆液，12ml含2.3mol·L^－1蔗糖的TKM液混匀, 装入离心管，下铺6ml含2.3mol·L^－1蔗糖的TKM液。再离心（27 000 r·min^－1, 30min）, 沉淀即为核。 核用缓冲液A（含0.25 mol·L^－1蔗糖，10mmol·L^－1 MgCl₂，1mmol·L^-1 DTT¹, 10mg·L^－1 leupeptin, 2 mmol·L^－1 PMSF², 50mmol·L^－1 Tris- HCl, pH 7.4）重悬, 加入10g·L^－1柠檬酸钠, 冰浴30min并轻轻搅拌,离心(500r·min^－1, 15min),去外膜核沉于管底。再用缓冲液A重悬沉淀,使核浓度为5g·L^－1，加入DNase I (250mg·L^－1), 在4℃消化14h, 进行蔗糖密度梯度(0.25、1.6、2.4mol·L^－1)离心(27000 r·min^－1, 2h), 内核膜位于0.25/1.60mol·L^－1蔗糖溶液界面。考马斯亮蓝法定量蛋白。按文献［6］方法测定标志酶活性：NAD焦磷酸化酶，NADPH细胞色素C还原酶。

1.3［³H］IP₃结合测定^［5］

内核膜用含50 mmol·L^－1 Tris-HCl，pH 8.0，2mmol·L^－1 EDTA悬浮，进行［³H］ IP₃结合反应，分别加浓度递增的［³H］ IP₃（0.05～1.5nmol·L^－1）, 反应体积400μl，加入核0.1mg蛋白/管 ，0℃下反应10min。 结合与游离的放射性配体（［³H］IP₃）用离心法（12000 r·min^－1, 5min）分离，上清抽吸去除，沉淀加1ml 组织溶解液(Soluene 350, Packard)、乙酸70μl，转至液闪杯中，用液闪仪测定［³H］ IP₃放射活性。 非特异结合通过加10μmol·L^－1 IP₃测定。由Scatchard分析得到K_d, B_max值。

1.4⁴⁵Ca²⁺ 转运测定^［5］

内核膜置于缓冲液B( mmol·L^－1, 250蔗糖，2 EGTA, 2 EDTA, 4 K₂HPO₄, 4 MgCl₂, 50 Tris-HCl, pH 8.0 )，并含2.08mmol·L^－1 CaCl₂ （游离［Ca^2＋］ 为1 μmol·L^－1）。 加入7.4×10⁴Bq·ml^－145Ca²⁺ (Amersham公司), 实验分两组, 一组加5 μmol·L^－1 IP₃，另一组加2μmol·L^－1离子霉素(ionomycin), 37℃反应并计时, 按不同时间点通过真空抽滤中止反应，内核膜被截留在GF/ B (whatman) 玻璃纤维膜。用3 ml冰冷的缓冲液B快速冲洗纤维膜, 后将其置于液闪杯中，干燥后在液闪仪测定⁴⁵Ca²⁺放射活性。转运的⁴⁵Ca²⁺ 量由给定时间点放射性减去开始的放射性求得。

1.5数据处理

实验数据均以±s表示，单因素方差分析或Student- Newman- Keuls检验。

2结果

2.1肝细胞核及内层核膜的鉴定

NAD焦磷酸酶是细胞核的标志酶^［5］，内层核膜上的活性约为匀浆的21倍［每分每毫克蛋白（78.26±5.44) vs （3.68±0.27) nmol］。而微粒体的标志酶NADPH细胞色素C还原酶，在内层核膜只有匀浆的1/8［每分每毫克蛋白（1.27±0.11) vs（10.27±0.87) nmol］。表明得到的核及内层核膜纯度高、污染小。上述标识酶在败血症组与对照组之间相近, 差别无统计学意义（P＞0.05）。<