摘要目的：了解线粒体肌病/脑肌病患者外周血细胞线粒体DNA的拷贝数量有无异常。方法：用分子杂交技术对10例线粒体肌病/脑肌病患者和16例正常对照者的外周血细胞线粒体DNA进行定量分析。结果：在线粒体肌病/脑肌病患者及正常对照者中，均未发现外周血细胞线粒体DNA的片段缺失；但前者线粒体DNA的拷贝数量较后者明显增多。结论：在线粒体肌病/脑肌病患者的外周血细胞中，线粒体DNA的数量较正常人明显增加，与其肌肉中线粒体的异常增生相一致。这一实验方法对线粒体肌病/脑肌病的初筛有一定价值。

中国图书资料分类法分类号R746.9

Quantitative analysis of mitochondrial DNA in peripheral

blood cellsof patients with mitochondrial

myopathy/encephalomyopathy

WANG Zhao-Xia^#, LI Xiao-Dong, CHEN Qing-Tang, HE Mao-Lin, WU Xiao-Jing

(#Department of Neurology, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing100034)

MeSHMitochondrial myopathiesMitochondrial encephalomyopathiesDNA，mitochondrial

ABSTRACTObjective: To determine the mitochondrial DNA contents in the peripheral blood cells of patients with mitochondrial myopathy/encephalomyopathy.Methods: A quantitative analysis was carried out in mitochondrial DNA of peripheral blood cells from patients with mitochondrial myopathy/encephalomyopathy and normal controls by Southern blotting.Results: Mitochondrial DNA deletions of peripheral blood cells were not found in patients, and nor in the normal control group. However, the amount of mitochondrial DNA in the peripheral blood cells in the patients was much higher than that in normal controls.Conclusison: In the peripheral blood cells of patients with mitochondrial myopathy/encephalomyopathy, the amount of mitochondrial DNA was much higher than that in the normal controls, which was consistent with the mitochondrial proliferation in the muscle cells of these patients. This method is of some value in screening mitochondrial myopathy/encephalomyopathy.

(J Beijing Med Univ,1999,31:255-257)

线粒体肌病和脑肌病是一大类以线粒体功能异常为主要病因学的疾病。它包括卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre syndrome)、慢性进行性眼外肌瘫痪(chronic progressive external ophthalmoplegia , CPEO)、肌阵挛型癫痫伴蓬毛样红纤维( myoclonic epilepsy with ragged-red-fiber, MERRF)、线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidemia and stroke-like episodes, MELAS)及以骨骼肌受累为主的线粒体肌病等。组织病理学检查所见的蓬毛样红纤维(ragged-red-fiber, RRF)和类结晶样包涵体是诊断此病的主要依据之一。最近的分子生物学研究表明此类疾病主要与线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的异常有关^［1,2］。本试验对线粒体肌病/脑肌病患者及正常对照者的外周血细胞mtDNA进行了定量比较，以了解线粒体肌病/脑肌病患者外周血细胞mtDNA的数量有无变化。

1材料与方法

1.1实验对象

实验对象分为线粒体肌病/脑肌病组和对照组。线粒体肌病/脑肌病组男、女各5例，23～55岁，来自1995～1997年本院神经内科门诊及住院病人；包括线粒体肌病6例，CPEO2例，MERRF2例，患者的临床特点均符合线粒体肌病/脑肌病临床诊断标准^［3］，除1例CPEO未做肌活检外，其余9例均经肌肉病理检查证实。正常对照组16例，其年龄分布与病例组相比差异无显著性，均来自本院工作人员中自愿献血者。

1.2主要实验材料

限制性内切酶PvuⅡ、蛋白酶K等生化试剂购自华美生物工程公司。α-³²P-dCTP购自亚辉生物技术公司。尼龙膜为美国Amersham公司产品。随机引物标记试剂盒购自美国Promega公司。mtDNA全长探针由美国华盛顿大学姜新生博士赠送，18SrDNA质粒由美国哥伦比亚大学Schon博士赠送。

1.3实验方法

提取外周血细胞总DNA：取肘静脉血5～10ml，38g·L^－1抗凝后，常规酚/氯仿法提取DNA。制备探针：mtDNA全长探针约16.6kb，18SrDNA探针约为5.8kb。Southern杂交：将2～5μg总DNA用PvuⅡ内切酶酶切后，8g·L^－1琼脂糖凝胶分离，转膜、杂交、放射自显影。将膜进行两次杂交，第1次只与mtDNA全长探针杂交，第2次则与mtDNA全长探针及18SrDNA探针(³²P标记)同时杂交。密度扫描：用激光扫描仪扫描X光片上的2个杂交条带，去除本底后，获取相对值。统计学处理：用成组比较t检验法将所得数据进行统计学处理。

2结果

当只用mtDNA全长探针进行杂交时，杂交片上只显示一条16.6kb的正常片段，未发现其它异常条带(结果未显示)。当与两个探针(mtDNA全长探针和18SrDNA探针)同时杂交时，杂交片上每个泳道显示两个杂交带(图1、2)，长度分别为16.6kb及12.0kb,前者密度代表mtDNA含量，后者是18SrDNA与核DNA的杂交带，其密度代表核DNA含量，将X光片用激光扫描仪进行二维扫描，得出两个条带各自的吸光系数乘以条带面积的积分值。二者的比值即为mtDNA的相对含量(表1)。由表1可见，线粒体肌病患者外周血mtDNA的数量与正常人相比，有显著性差异，前者约为后者的2.8倍。

1－4，7，10， mitochondrial myopathy; 5,8, CPEO; 6,9， MERRF.

图1线粒体肌病/脑肌病组外周血细胞DNA的Southern杂交图谱

Figure 1Autoradiograms of Southern blot

of total DNA in peripheral blood cells from patients

with mitochondrial myopathy/encephalomyopathies

表1病例组和对照组外周血细胞线粒体DNA数量的统计学分析

Table 1Statistical analysis of mtDNA amount

in peripheral blood cells between patient group and control one

Groups s t P Patients

Control 0.76

0.27 0.21

0.17 5.98 ＜0.01

图2正常对照组外周血细胞DNA的Southern杂交图谱

Figure 2Autoradiograms of Southern blots of total DNA

in peripheral blood cells from normal controls

3讨论

我们的实验结果表明，在线粒体肌病/脑肌病患者的外周血细胞中，用Southernblot法未发现mtDNA的缺失，与文献报道一致^［4］。此因mtDNA具有异质性和有丝分离性(mitoticsegregation)，即野生型和突变型mtDNA可存在于同一类细胞中，但它们可随细胞分裂而分配到不同细胞，最终可能达到同质性。分裂旺盛的细胞(如血细胞)往往有排斥突变mtDNA的趋势，朝着具有全部正常型mtDNA的方向发展；而分裂不旺盛的细胞(如肌细胞)则会逐渐累积突变型的mtDNA，朝着具有全部突变型mtDNA的方向发展。所以在有突变的病人中，不同组织间野生型和突变型mtDNA的比例相差很悬殊，肌肉、脑、肝、肾所含的突变mtDNA比例较高，这些组织可用Southernblot检测到缺失；而外周血中缺失型mtDNA的比例很少，极少报道用Southernblot检测到外周血中mtDNA的缺失(除了Pearson's综合征患者，其外周血mtDNA缺失的比例很高，可用Southernblot检测到缺失的存在)^［5］。

近10年的分子生物学研究表明，在线粒体肌病/脑肌病中，KSS和CPEO与mtDNA的4977bp片段缺失有关，MERRF和MELAS则与mtDNA的点突变有关(前者与nt8344、nt8356，后者与nt3243、nt3271有关)^［3］。但关于mtDNA的拷贝数量的变化，尤其是mtDNA与线粒体二者数量的增加是否同步，文献报道较少。Moraes等对200多名不同类型线粒体脑肌病和线粒体肌病患者的肌肉进行了Southern杂交分析，发现与肌纤维内线粒体的增生相一致的是，大部分患者的mtDNA的拷贝数量亦增加。我们采用以前介绍的方法