摘要目的：研究神经节苷脂GM1对β淀粉样蛋白（Aβ）分泌和β淀粉样蛋白前体（APP）基因转录水平的影响，探讨GM1在阿尔茨海默病Aβ生成过程中的作用机制。方法：利用人类APP695基因转染神经母细胞瘤细胞株，免疫沉淀Western印迹法检测经不同浓度GM1处理的细胞培养液中的Aβ含量，逆转录多聚酶链反应（RT-PCR)法测定细胞中APP mRNA水平。结果：随GM1浓度增加，细胞分泌Aβ增加，GM110μmol^．L^－1组和100μmol^．L^－1组分别为对照组的1.33倍（t=1.29, P＞0.05）和3.07倍（t=3.63, P＜0.05）；而APP mRNA水平无变化，APP特异性片段与内参照的比值3个组无显著性差异（F=0.23,P＞0.05）。结论：GM1不影响APP基因转录水平，其促进细胞分泌Aβ的作用可能与干扰APP的水解代谢有关。

中国图书资料分类法分类号R742

Effects of ganglioside GM1 on the secretion of amyloid

β-protein and the transcription of amyloid-β

protein precursor gene in Alzheimwe disease

ZHANG Hui^＃，KANG De-Xuan，RUAN Yan， ZHANG Dai

(＃Department of Neurology, the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing100083)

MeSHAlzheimer's disease/genetTranscription, geneticG(M1)Ganglioside/pharmacolAmyloid beta-protein precursor/metab

ABSTRACTObjective: To study the effects of ganglioside GM1 on the secretion of amyloid-β protein(Aβ) and the transcription of amyloid β-protein precursor(APP) gene, and to discuss the mechanism of GM1 in the generation of Aβ in Alzheimer disease.Methods: Neuroblastoma cell line(SH-SY5Y) stably transfected with human APP695 cDNA were used. The cells were treated with different concentrations of GM1. The level of Aβ in the medium was checked by immunoprecipitated Western bloting, and the level of cell APP mRNA was measured by RT-PCR method.Results: The level of Aβ secreted by the cells of the GM1 treated groups (10 μmol^．L^－1 and 100μmol^．L^－1) were 1.33（t=1.29, P＞0.05）and 3.07 （t=3.63, P＜0.05）fold higher than that of the control group， respectively. The ratio between APP and GAPDH fragments of RT-PCR products didn't show difference（F=0.23, P＞0.05）．Conclusion: GM1 does not influence the transcription level of APP gene. Its effect on the secretion of Aβ may be contributed by the interference on the proteolysis of APP.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:252-254)

阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）最主要的病理特征之一是老年斑（senile plaques，SP）形成。β-淀粉样蛋白(amyloid-βprotein，βA4或Aβ）是SP的核心成份。AD病人脑中SP的数量与痴呆的严重程度呈正相关。因此，对于有关影响Aβ的生成、降解、聚集等因素的研究成为现今AD研究的热点之一。Aβ是它的前体蛋白——β-淀粉样蛋白前体（amyloid β-protein precursor，APP）的代谢产物^［1］，因而，影响APP表达及代谢的因素势必在Aβ生成过程中起重要作用。

神经节苷脂（gangliosides）GM1是中枢神经系统细胞膜的重要组成部分。对于GM1与AD的关系，目前研究存在争议。一方面，GM1具有促进神经生长的作用，对损伤后的神经组织有营养和修复等功能，临床上应用GM1治疗周围神经损伤、脊髓损伤和中风等，甚至有学者将其试用于AD的治疗^［2］。另一方面，研究发现，AD病人血中检出显著GM1抗体^［3］，AD病人脑组织中的质膜Aβ可与GM1紧密结合^［4］，膜结合型的GM1可以促进Aβ的纤维化^［5］，说明GM1有可能参与AD的发病机制。近期研究发现，外源性给予GM1可使人类APP695基因转染细胞分泌Aβ增加^［6］，细胞中APP含量增加^［7，8］。本研究即是在此基础上，利用APP695基因转染细胞模型，探讨GM1增加Aβ生成的作用是否与促进APP基因表达有关。

1材料与方法

1．1细胞模型与培养

人类APP695 cDNA转染人神经母细胞瘤细胞株（HY-SY5Y，德国海德堡大学分子生物学中心提供）。将细胞等分于3个50 ml培养瓶培养，每瓶加10 ml 培养基 （MEM及 F-12各半，加体积分数为10%的灭活胎牛血清，潮霉素B0．4mg^．L^－1，购于Gibco和BM公司)，于37℃，5%（体积分数）CO₂条件下培养，至细胞贴壁生长密度大于95%。弃培养液，用1×PBS（pH 7．5）洗涤，分别加入不含血清培养基3ml，两实验组分别加入10和100μmol^．L^－1GM1，对照组细胞加入等体积PBS（pH 7．5）。细胞于37℃，5%（体积分数）CO₂条件下培养8h。

1．2免疫沉淀及Western印迹检测培养基中的Aβ含量

分别取各组培养基，2500r^．min^－1离心20min，取上清。各加入抗Aβ_1-16单克隆抗体W0-2（德国海德堡大学分子生物学中心提供）5μg，蛋白质G-agarose 25μl(BM公司)，于室温旋转混合4h。离心（2500r^．min^－1，20min）后弃上清，沉淀物用10mmol^．L^－1 Tris缓冲液（pH7．4）洗涤3次，加2×加样缓冲液各25μl，于95℃变性10min。离心，取上清上样。采用100g^．L^－1Tris-Tricine 凝胶电泳，电泳结束后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(350mA，40min)。NC膜置于PBS（pH7．5）中煮沸5min，室温下以100g^．L^－1脱脂奶粉（溶于PBS）封闭1h，PBS漂洗3次，加入一抗W0-2（体积比1∶2000稀释于2．5g^．L^－1牛血清白蛋白的PBS中）室温下孵育1h。PBS漂洗后加碱性磷酸酶偶联抗鼠IgG（体积比1∶2000稀释于2.5g^．L^－1牛血清白蛋白的PBS中）室温孵育1h，用PBS漂洗后以BCIP/NBT系统染色。

1．3RT-PCR

移去培养基的细胞用PBS洗涤，用RNA提取试剂(Life Technologies公司产品)及其提供的方法提取总RNA，并用该公司推荐方法进行逆转录，获得cDNA。

PCR APP695片段，上游引物5′-CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC-3′，下游引物5′-CTT GCA CCA GTT CTG GAT G-3′，扩增片段长度294bp。PCR反应条件，95℃3min后；94℃变性30s，60℃退火1min，70℃延伸1.5min；共35个循环，最后72℃10min。内参照采用3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH），扩增片段长度572bp，扩增条件详见文献［9］。扩增完毕后两种PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳。

1．4结果统计

Western印迹结果经AGFA ARCUS Ⅱ扫描仪读取，PCR产物电泳结果经Kodak数字照相机拍照，采用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software软件系统定量分析，吸光度数值用SPSS软件单因素方差分析及配对t检验进行统计学分析。

2结果

细胞培养液中加入GM1后细胞分泌的Aβ含量增加，5次独立实验均得到相同结果（F=9.45, P＜0.01）。经配对t检验，10μmol^．L^－1 GM1组细胞分泌Aβ的含量为对照组的1.33倍（t=1.29, P＞0.05），而 100μmol^．L^－1组是对照组的3.07倍（t=3.63, P＜0.05），证明经较高浓度的GM1处理，细胞分泌的Aβ含量增加具有统计学意义（图1）。

1, low molecular protein standard; 2, control group;

3 and 4, GM1 treated guoups ［10μmol^．L^－1 （3）

and 100μmol^．L^－1 （4）respectively］.

图1GM1促进APP695细胞分泌Aβ

Figure 1GM1 increases the secretion of Aβ on APP695 cells

RT-PCR结果：APP特异性片段与内参照的光密度比值3个组分别为1.38±0.32, 1.35±0.18和1.45±0.16。配对t检验结果，10μmol^．L^－1组为对照组的0.97倍（t=0.52, P＞0.05），100μmol^．L^－1组是对照组的1.07倍（t= 0.61, P＞0.05）。3组之间无统计学差别（图2）。

1, nucleic acid molecular