摘要目的：口服髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)与T细胞疫苗接种(T cell vaccination, TCV)联合应用诱导免疫耐受，以提高特异性的免疫疗法对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)的防治效果。方法：从gpSCH/CFA诱发EAE的DA大鼠体内取淋巴细胞，体外再以MBP刺激，并用rIL-2促进增殖，反复数个循环，可获得MBP特异的T淋巴细胞系。将此T细胞系经照射(15 Gy)灭活处理后，静脉接种至同基因正常DA大鼠体内，同时给此DA大鼠多次口服MBP诱导耐受，最后以脊髓匀浆/完全福氏佐剂(SCH/CFA)攻击经上述处理的大鼠，以观察其EAE的发病情况。结果：单独口服MBP诱导耐受及单独TCV处理的DA大鼠对随后诱发的EAE的抑制率分别为67％和50％，而将二者联合应用，则抑制率可达80％。结论：口服MBP与MBP特异的T细胞疫苗接种联合应用，可获得更深程度的耐受效果，多种手段联合应用可能成为临床今后通过诱导耐受防治自身免疫病的新策略。

中国图书资料分类法分类号R512.3-332

Suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis

in DA rats using the combination of oral tolerance and T cell vaccination

LIU Xue-Bin, WU Jin-Ling, XIE Shu-Sheng

(Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083)

MeSHEncephalitogenic basic proteins/ther useEncephalomyelitis/drug effImmunological toleranceT cell vaccination☆Encephalitis, post-vaccinal

ABSTRACTObjective：To improve the therapeutic effects of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by induction of specific immunologic tolerance, we explored the effects of the combination of inoculation with attenuated myelin basic protein (MBP)-reactive T cell lines and oral administration of MBP on prevention of EAE induced by gpSCH/CFA in DA rats. Methods：DA rats were immunized with gpSCH/CFA. 9 days later, mBP-specific CD4＋T cells were isolated from draining lymph node cells at the site of immunization, and were cultured in vitro in the presence of 1 mg．L－1 MBP Then they were isolated by density gradient centrifugation and expanded in vitro in the condition medium containing rIL-2. After several rounds of MBP-dependent activation and rIL-2-driven expansion, the amount of the mBP-specific CD4＋ T cells were sufficient to be transfed into naive DA rats to induce tolerance or transfer eAE. The induction of oral tolerance was performed in the DA rats of the same group by oral administration of 1mg MBP for five times within a narrower time frame (day －10, －8, －6, －4, and －2). After the above treatment, the rats were challenged with 200 μg gpSCH emulsified in CFA to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis, and then to assess the resistance of the tolerant DA rats to EAE. Results：Oral tolerance and T cell vaccination (TCV) were used in combination could enhance the inhibition efficiency of EAE in DA rats 13 or 30 percentage higher than of oral tolerance alone orTCValone, respectively. Conclusion：The data obtained indicate that TCV and oral tolerance were used in combination are more effective on suppression of EAE induced with gpSCH/CFA, which may be considered as a novel therapeutic stratege.

(J Beijing Med Univ, 1999,31：247-251)

多发性硬化症（multiple sclerosis, MS）是由自身反应性CD4^＋T淋巴细胞介导的、以中枢神经系统（central nervous system, CNS）血管周围单核细胞浸润和白质脱髓鞘为典型特征的神经系统自身免疫性疾病。目前，尽管对MS发病机制的研究取得了许多重要进展，但临床上对MS的治疗仍无理想的治疗方法。研究表明，诱导机体对自身抗原特异性的免疫耐受，是预防和治疗自身免疫病的理想方法^［1］。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）为发生于动物中枢神经系统内，由MBP特异的自身反应性CD4^＋T淋巴细胞所介导的自身免疫性疾病，EAE与MS在临床、生化、免疫及病理等诸方面都具有相同的特征，是公认的MS的理想动物模型^［2］。近年来，以MS的动物模型EAE为研究对象，通过诱导抗原－特异性的免疫耐受，如口服耐受或T细胞疫苗接种预防和治疗EAE的研究，在实验动物的研究中已取得了令人鼓舞的效果，但上述疗法在临床上单独应用时，其效果仍不尽人意。本研究发现口服耐受与T细胞疫苗接种联合应用能加强耐受诱导的深度，明显提高防治EAE的疗效。

1材料与方法

1.1材料

动物：豚鼠，体重300～400g。DA纯系大鼠，6～8周龄，雌性，体重30～180g，均由北京医科大学实验动物部提供。

试剂：髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP，本室从豚鼠脑、脊髓中提取产品，以豚鼠脑、脊髓为预料，通过反复去脂、抽洗、酸溶解、高速离心等步骤提取MBP，再过柱进一步纯化，－20 ℃保存备用）， MBP标准品（Sigma公司，美国)，完全福氏佐剂（complete Freund's adjuvant, CFA，DIFCO LABORATORIES产品, 美国）, 百日咳疫苗（10×10¹⁰ml^－1，北京生物制品研究所疫苗室产品）。

1.2方法

抗原(完全福氏佐剂)的乳化：豚鼠心脏抽血处死，取脊髓制成500g·L^－1的脊髓匀浆（spinal cord homogenate, SCH），与等量的4g·L^－1卡介苗的CFA混合，置两只注射器中来回抽推制成gpSCH/CFA油包水乳剂，4℃保存备用。

EAE的诱导^［3］：于DA大鼠一侧后足跖真皮内注射gpSCH/CFA乳剂0.1ml, 同时大鼠后脚背皮内注射0.2ml百日咳疫苗（约2×10¹⁰个菌体），对照组单纯注射完全福氏佐剂。每天观察EAE发病情况,并按下列标准对神经症状分级评分：0级，无明显异常；1级，鼠尾麻痹；2级，后肢无力；3级，后肢麻痹；4级，后肢麻痹伴有前肢无力或麻痹或因EAE而死亡。组织病理学检查: 部分大鼠于发病将近死亡、刚死亡或免疫后第16天处死，迅速取脑和脊髓固定于0.1kg·L^－1福尔马林液中，石蜡包埋，切片（厚7～10μm），HE染色，光镜下观察摄片。

口服耐受的诱导^［4］：将MBP溶解于PBS中，配成1g·L^－1备用。于致敏前第10、8、6、4、2天分别给大鼠灌胃MBP一次，每次每鼠1.5mg，共5次，对照组口服PBS或卵清蛋白(ovalbumin, OVA)，于致敏当天用gpSCH/CFA免疫大鼠主动诱发EAE，此后每天观察上述动物发病及疾病进展情况。

T细胞疫苗的制备^［5］：用gpSCH/CFA免疫DA大鼠9d后，无菌取大鼠注射抗原一侧的腹股沟淋巴结，制备单个淋巴结细胞悬液，用刺激培养基（RM：体积分数为2％的同基因DA大鼠血清的不完全RPMI-1640培养液）调细胞浓度至1×10⁷ml^－1，取5ml细胞悬液于60mm培养瓶中，加MBP(50 mg·L^－1)于37℃，5％(体积分数)CO₂孵箱中培养3d，刺激MBP特异的T细胞，使之活化。培养72h后，收集细胞，室温离心(1200r·min^－1,10min)，用2ml RPMI-1640液重悬细胞。用3ml Ficoll淋巴细胞分离液于1700r·min^－1, 30min条件下分离淋巴细胞液活化的T细胞母细胞。加入完全RPMI-1640液，调细胞浓度至1×10⁶ ml^－1，同时加入rIL-2（作为T细胞生长因子）80u·ml^－1,于60mm培养瓶中 (每瓶5 ml), 37℃，5%(体积分数)的CO₂中培养。3d后，用RM调T细胞浓度至1×10⁶ml^－1，与1×10⁷ml^－1同基因DA大鼠胸腺细胞悬液(30Gy照射后)及50μl MBP，在37℃, 5％(体积分数)的CO₂孵箱中共同培养2～3d。培养结束后，用Ficoll分离活化的T细胞，再以含rIL-2的生长培养基培养扩增4d。在T细胞生长培养基中，当T细胞开始变小，并不再增殖时，则用MBP再次刺激T细胞活化，并培养扩增。如此反复，经过几个活化、扩增循环后，便可得到足够数量的MBP反应T细胞，以便用于过继转移疾病或用作制备T细胞疫苗。

T淋巴细胞减毒疫苗制备及接种：取MBP反复刺激，扩增后得到的T淋巴细胞系，用RPMI-1640培养液调细胞浓度至1×10⁷ml^－1，用15GyCo⁶⁰照射进行灭活处理。将上述细胞经舌下静脉接种到正常同基因的DA大鼠，每只鼠1×10⁷，隔周接种，共接种3次。最后一次接种完成后1周，用gpSCH/CFA攻击受体大鼠(方法同前)。每天观察并记录发病情况。

T细胞疫苗接种与口服MBP联合诱导耐受：于致敏前第21、14、7天分别给大鼠接种照射处理(30 Gy)的MBP反应T淋巴细胞系，接种量为每只鼠1×10⁷。于致敏前第10、8、6、4、2天分别给同一组接种T细胞疫苗