摘要目的：观察混合脐血浆在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)培养中的作用。方法： 在含20%(体积分数)混合脐血浆的内皮细胞培养体系中进行HUVEC的原代和传代培养，并对培养细胞进行纯度鉴定。同时用噻唑蓝试验观察不同体积分数的混合脐血浆对HUVEC增殖活力的影响。结果:20%(体积分数)的混合脐血浆对HUVEC培养有明显支持作用,该体系培养的HUVEC经第Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ:Ag)和Ⅰ型荆豆凝集素(UEA-Ⅰ)鉴定纯度可达93.1%。结论：20份混合的脐血浆可以代替内皮细胞生长因子成功地用于HUVEC的培养，以获得高纯度可传代的内皮细胞。

中国图书资料分类法分类号Q2-33

Effect of mixed umbilical cord blood plasma on the culture

of human umbilical vein endothelial cells

LI Zhi-Ping, LI Jin-Lan, FU Jia-Yu, CHEN Shan-Shan

(Institute of Hematology, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing100034)

MeSHEndothelium, vascular/growthUmbilical veinsCells, culture

ABSTRACTObjective: To observe the effect of mixed umbilical cord blood plasma on the culture of human umbilical vein endothelia cells (HUVEC).Methods: Primary and passaged HUVEC were cultured in the medium with 20% mixed umbilical cord blood plasma and their purities were evaluated by Ⅷ:Ag and UEA-Ⅰ.Proliferative activities of HUVEC were compared in the medium containing different amounts of mixed umbilical cord blood plasma by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay.Results: 20% mixed umbilical cord blood plasma can maintain cell viability in the medium without endothelial cell growth factor(ECGF). The purity of endothelial cells was 93.1%.Conclusion: 20-portion-mixed umbilical cord blood plasma can be a substitute for ECGF and used successfully in the culture of HUVEC to obtain high purity and passagable endothelial cells.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:280-282)

血管内皮具有多种功能，它除了是血液和组织间代谢交换的屏障外，还可以产生和分泌多种生物活性物质,对调节血压和体液平衡具有重要意义。尤其近年来证明内皮细胞可以支持造血^［1］。为适应内皮细胞的研究需要，自从1973年Jaffe等^［2］首先成功地在体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)以来,由于HUVEC来源充足,取材、操作方便,已成为内皮细胞体外试验的主要材料。HUVEC的传代培养必需加用内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor, ECGF)，但其价格昂贵。本文应用混合脐血浆支持HUVEC的体外培养获得成功，并对培养细胞进行纯度鉴定。同时观察了不同体积分数的混合脐血浆对HUVEC增殖活力的影响。

1材料与方法

1.1混合脐血浆的制备

脐血采自健康产妇所生正常足月新生儿。胎盘娩出前无菌收集脐血，肝素(25U^．ml^-1)抗凝,400g离心20min,分离血浆，－20℃冻存。将分离的20份脐血浆混合，0.45μm和0.22μm微孔滤膜过滤,分装后－20℃保存备用。

1.2HUVEC的培养

按Jaffe等^［2］方法稍加改进。无菌条件下取健康产妇的胎儿脐带,如不立即培养可于脐带保存液中4℃保存（不超过24h）。剪除破损或有夹痕及血肿部分。脐静脉一端插入三通管并结扎。无钙、镁Hanks液(D-Hanks液)冲净脐静脉内的残血。脐静脉另一端也插入三通管并结扎,注入D-Hanks液充满血管，检察无外漏后，放出D-Hanks液，注入2.5g^．L^－1胰蛋白酶使血管充盈，37℃水浴中孵育8～10min。将细胞-酶液流入加有2ml小牛血清(FCS)的50ml离心管中，1000r^．min^－1离心10min。再用含10%(体积分数)FCS的RPMI 1640洗涤1次，台盼蓝染色计数后接种于铺有10g^．L^－1明胶的35mm培养皿。培养体系为RPMI1640含10%(体积分数)FCS、20%(体积分数)混合脐血浆。37℃、5%(体积分数)CO₂培养24h后换液去除红细胞和其它未粘附细胞。随后每周换液两次，直至细胞生长成单层。本实验中7～8d原代培养的细胞可以达到80%～90%汇合，用0.5g^．L^－1胰蛋白酶-0.2g^．L^－1 EDTA室温消化30～40s进行传代培养。

1.3内皮细胞的鉴定

1.3.1间接免疫荧光法检测第Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ:Ag)细胞爬片经40g^．L^－1多聚甲醛固定后，与Ⅷ:Ag兔抗血清(上海生物制品研究所)37℃孵育30min，PBS洗涤后，再与羊抗兔IgG-FITC孵育30min，荧光显微镜下观察结果。阴性对照用PBS代替兔抗血清。

1.3.2Ⅰ型荆豆凝集素结合率消化HUVEC呈单细胞悬液，PBS洗涤后，加入终浓度为80mg^．L^－1的FITC标记的Ⅰ型荆豆凝集素(UEA-I-FITC，Sigma)，室温避光反应30min，PBS洗涤后，流式细胞仪(FCM)(FACStar，美国BD公司)进行检测。阴性对照用PBS代替UEA-I-FITC。

1.4不同浓度混合脐血浆对HUVEC增殖活力的影响(MTT试验)

消化HUVEC呈单细胞悬液，用含10%(体积分数)FCS的RPMI 1640洗涤1次,调整细胞浓度至3×10⁵ml^－1。以3种培养体系分别含10%(体积分数)FCS、10%(体积分数)FCS加10%(体积分数)混合脐血浆、10%(体积分数)FCS加20%(体积分数)混合脐血浆，每孔100μl接种于96孔板，每一体系平行接种10孔，分别于24、48、72h后加入MTT工作液（1g^．L^－1）, 每孔10μl,37℃、5%(体积分数)CO₂反应4 h后加入100g^．L^－1SDS-0.01mol^．L^－1HCl终止反应，用酶标仪在570nm波长下测定每孔A(光密度)值。

2结果

2.1HUVEC的形态学观察

倒置显微镜下HUVEC单层生长呈短梭形或鹅卵石样镶嵌排列。原代及传代细胞均具有上述特点（图1）。

图1HUVEC的形态学观察×100

Figue 1The morphology of HUVEC×100

2.2Ⅷ:Ag检测

原代及传代细胞均呈阳性反应而对照为阴性。

FCM检测UEA-Ⅰ阳性率为93.1%(图2)。

lg fluorescence intensity(UEA-Ⅰ-FITC).

图2FCM检测HUVEC的UEA-Ⅰ阳性率

Figure 2The binding rate of cultured HUVEC

and UEA-Ⅰ detected by FCM

2.3混合脐血浆对HUVEC培养的影响

我们共进行了60次HUVEC原代培养，其中10次培养体系中未加脐血浆，均未能培养成功。在传代培养中如不用脐血浆，细胞生长缓慢，无法形成单细胞层，最后细胞脱落悬浮死亡。而加入混合脐血浆的HUVEC能较好地传代。另外，混合脐血浆的份数也影响内皮细胞的生长，应用8份混合的脐血浆，10次原代培养仅1次成功，而20份混合者10次原代培养有9次成功，表明脐血浆之间存在批间差异，多份混合方能消除此种差异。2.4不同浓度的混合脐血浆对HUVEC增殖的影响

MTT试验结果表明不同浓度的混合脐血浆对HUVEC的增殖活力有不同影响。如表1所示,在不含混合脐血浆的培养体系中培养24h，HUVEC的活力即有减低(P＜0.05), 此时低体积分数(10%)的混合脐血浆尚能维持其活力。至48h 10%(体积分数)混合脐血浆已不足以维持其活力。只有20%(体积分数)的混合脐血浆才能维持HUVEC的活力至72h。

表1不同体积分数的混合脐血浆

对HUVEC增殖活力的影响(A₅₇₀，±s, n=10)

Table 1The effects of cord blood plasma of different

volume fraction on the proliferation of HUVEC(A₅₇₀，±s, n＝10)

Groups t/h