摘要目的：探讨白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1ra)治疗博莱霉素(bleomycin, BLM)致大鼠肺纤维化模型的作用机制。方法：利用MTT法测定经IL-1ra作用前、后1周时该模型大鼠肺泡巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)，及其培养上清促肺成纤维细胞增殖能力的变化；利用Northern杂交测定肺泡巨噬细胞TNF-α、血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF) mRNA的表达。结果：BLM致肺纤维化模型1周时，肺泡巨噬细胞TNF-α的产生及该组细胞上清的促成纤维细胞增殖活性与正常对照组相比均明显增强,而IL-1ra（10mg^．L^－1）对肺泡巨噬细胞TNF-α的产生及该组细胞上清的促成纤维细胞增殖活性有明显的抑制作用。BLM致肺纤维化模型1周时肺泡巨噬细胞TNF-α、PDGF mRNA的表达较正常对照组增高,而IL-1ra对其表达无明显影响。结论：IL-1ra通过对肺泡巨噬细胞的TNF-α产生及其对成纤维细胞增殖活性的抑制,可能对该模型的肺纤维化起到抑制作用。

中国图书资料分类法分类号R563

Effect of interleukin-1 receptor antagonist

on bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats

ZHAO Gui-Rong， HE Bing， LI Hai-Chao， SU li， LI Xiao-Ling

（Department of Respiratory Medicine, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing100034）

MeSHPulmonary fibrosis/drug therReceptors, interleukin-1/antagFibroblasts/drug effMacrophages, alveolar/secret

ABSTRACTObjective:To investigate the therapeutic mechanism of interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) on bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats.Methods: MTT means was adopt to measure the alternations of alveolar macrophages(AMs)-derived tumor necrosis factor-α(TNF-α)of rats and changes of fibroblasts proliferation induced by the conditional media of AMs in the first week after IL-1ra interfered. Northern blot hybridization was used to analyse the expressions of TNF-α and platelet-derived growth factor(PDGF) mRNA.Results: The production of AMs-derived TNF-α and the capacity of fibroblasts-proliferating of conditional media of AMs were both elevated obviously in fibrosis group on the 7th day, compared with those in the control group. Whereas, the elevations had been inhibited significantly by IL-1ra(10 mg^．L^－1). The expressions of TNF-α and PDGF mRNA of AMs of fibrosis group on the 7th day were increased, compared with those of the control group. IL-1ra(10mg^．L^－1) had no effect on the expressions.Conclusion: IL-1ra may play a role in interrupting pulmonary fibrosis of the model through inhibiting the production of AMs-derived TNF-α and the capacity of fibroblasts-proliferating of AMs.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:277-279)

弥漫性肺间质纤维化是以肺泡炎和间质胶原纤维沉积为特点的一组疾病。随着对肺纤维化发生机制的深入研究，人们发现细胞因子在其发生、发展中起着重要的作用。而利用细胞因子的拮抗性物质对肺纤维化进行试验性治疗则成为当前的一个研究方向，目前有TNF-α可溶性受体、转化生长因子-β(TGF-β)抗体及IL-1ra等减轻肺纤维化形成的报告^［1］。

以往的研究发现，IL-1可刺激肺泡巨噬细胞产生TNF-α、IL-6等，介导炎症的形成。有关人类肺纤维化的研究并未能肯定IL-1在其发生中起作用，而在博莱霉素(bleomycin, BLM)致肺纤维化模型中,IL-1也只是在开始的数小时至1周内有轻度而短暂的升高^［2］。国外文献曾报道IL- 1ra对博莱霉素致大鼠肺纤维化模型的治疗作用，而我科以前的研究显示IL-1ra在体内实验中并无明显作用^［3］。为了探讨IL-1ra的作用及机制 ，我们对其在BLM致大鼠肺纤维化模型中的作用进行了研究。

1材料与方法

1.1试剂与细胞株

IL-1ra及TNF-α敏感的WEHI细胞株由北京医科大学免疫学教研室提供，TNF-α标准品购自军事医学科学院邦定公司，PDGF购自美国ADCC公司。

1.2模型的制作

雄性Wistar大鼠、体重200～300g，共10只。随机分为2组，①正常对照组：5只；②肺纤维化模型7d组：5只，经乙醚麻醉后经气管插管一次性给入4g^．L^－1BLM5mg^．kg^－1制成模型，于1周时处死。

1.3细胞的分离培养

各组大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后经腹主动脉放血处死，37℃预温的PBS充分右室灌流。4℃预冷的PBS100ml分次行支气管肺泡灌洗。离心收集细胞。RPMI1640（含体积分数为10%的FCS）1×10⁶ml^－1细胞重新悬浮细胞，置培养皿中，37℃、5%(体积分数)CO₂孵育箱培养1h使巨噬细胞贴壁，弃去上清，加入等量含IL-1ra(10mg^．L^－1)的RPMI1640培养基。正常对照组及肺纤维化模型7d组各分为两组，分别加入RPMI1640、RPMI1640加IL-1ra。37℃、5%(体积分数)CO₂孵育箱培养18h，收集上清，分装，－70℃冻存待检。对各亚组细胞采用一步法提取总RNA。

1.4TNF-α含量的测定（MTT法）^［4］

每孔100μlWEHI细胞2×10⁴加入96孔板中。分别加入倍比稀释的TNF-α标准品及待测上清各100μl，37℃、5%（体积分数）CO₂孵育箱培养至TNF-α标准品孔出现明显的杀伤梯度，约需16～24h。加入10μlMTT（5g^．L^－1）继续培养4h，加入20%（体积分数）SDS/50%（体积分数）DMSO的裂解液（pH4.0）100μl，37℃过夜。于570～620nm测定光密度值，绘制标准曲线，计算各组待测上清中的TNF-α含量。

1.5肺成纤维细胞增殖的测定（MTT法）

经灌洗的正常组大鼠的肺组织用贴块法培养肺成纤维细胞，传至4～5代。消化后收集细胞，加RPMI1640（含体积分数为0.4%的FCS），调整细胞数为5×10⁴ml^－1，每孔200μl加入96孔板中，37℃、5%（体积分数）CO₂孵育箱培养48h。弃去培养基，分别加入RPMI1640（体积分数为0.4%的FCS）及各组培养上清各200μl，培养44h。每孔中加入MTT（10g^．L^－1）15μl，继续培养4h。每孔加入DMSO100μl使细胞充分裂解，于570～620nm测光密度值。

1.6TNF-α、PDGFmRNA表达的测定

上述各组肺泡巨噬细胞的总RNA（15μg）进行甲醛变性凝胶电泳，经Northern印迹法将RNA转移至尼龙膜上。分别同³²P标记的TNF-α、PDGF、及18S(内参照)cDNA探针进行杂交。－70℃放射自显影72h。X线胶片经计算机光密度扫描进行定量。

1.7统计学处理

以上结果经SSPC软件包进行统计学处理。

2结果

2.1肺泡巨噬细胞培养上清中TNF-α的测定及该培养上清对肺成纤维细胞增殖的影响

在BLM模型7d组,肺泡巨噬细胞产生的TNF-α显著增加,经IL-1ra作用后,其TNF-α的产生明显受到抑制。BLM7d组肺泡巨噬细胞上清的促增殖活性较正常对照也显著增加,而IL-1ra(10mg^．L^－1)可显著抑制这种促增殖活性(表1)。

表1肺泡巨噬细胞培养上清中TNF-α的质量浓度及对肺成纤维细胞增殖的影响(±s)

Table 1Mass concentration of TNF-α and fibroblasts-proliferating

effect of supernatants of alveolar macrophages(±s)

Normal control IL-1ra group Fibrosis group Fibrosis+IL-1ra ρ(TNF-α）／U^．ml^－1 294±94 302±87 980±263 353±78^ A 0.24±0.04 0.22±0.04 0.28±0.03 0.22±0.04^

A, absorbance meaned proliferation of fibroblasts; *P＜0.05， vs normal control；** P＜0.05， vs fibrosis group (7th day)．2.2IL-1ra对PDGF、TNF-αmRNA表达的影响