摘要应用北京医科大学培育的听源性癫痫易感大鼠P77PMC，以癫痫不易感大鼠Wistar为对照，系统研究了NMDA受体亚单位Ⅰ(NR-1)与白细胞介素-1(IL-1)在癫痫发生发展中的作用及相互关系。实验在整体、脑片、神经细胞培养及分子水平进行。所得较有意义的结果如下：(1)在听源性惊厥易感大鼠P77PMC整个发育过程中脑内NR-1 mRNA的表达，以及成年鼠脑内NMDA受体活性(MK-801结合)都高于对照组Wistar大鼠。惊厥后P77PMC脑内NR-1 mRNA的表达呈时间依赖性增加，惊厥后24 h比惊厥前增加111%～202%；NR-1反义寡核苷酸脑室注射(每μl10μg)可显著减轻P77PMC大鼠惊厥程度，并可对谷氨酸引起的体外神经细胞的损伤有保护作用,抑制谷氨酸导致的神经毒性作用。由此证实NR-1参与惊厥的发生发展，并与P77PMC大鼠的遗传性癫痫易感性关系密切。(2)在神经细胞培养中IL-1β可明显剂量依赖性地(1～25U^．ml^-1)提高NR-1 mRNA的表达，白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)可阻断此效应；IL-1β可剂量依赖性地提高NR-1受体活性,因此提示IL-1具有兴奋性神经调质的作用，其作用可能是通过直接或间接地促进脑内NR-1基因表达与受体功能。(3)应用缺陷型单纯疱疹病毒(HSV)pHSVLac载体(由哈佛大学Geller教授惠赠)构建含IL-1ra cDNA的pHSV-IL-1ra载体,进行转基因表达IL-1ra。侧脑室注射pHSV-IL-1ra假病毒(5×10⁵pfu)可显著抑制P77PMC大鼠的惊厥发作。相关脑区有IL-1ra mRNA及蛋白的表达，可长达6周以上，说明HSV载体可有效地将IL-1ra基因转移入脑内。

中国图书资料分类法分类号R742.1-332

The effects of NMDA receptor-1 and interleukin-1 on

the pathogenesis of epilepsy

WU Xi-Ru， SHAN Wei-Song， ZHANG Guo-Rong

(Department of Pediatrics, the First Hospital,

Beijing Medical University, Beijing100034)

MeSHReceptors, N-methyl-D-aspartateInterleukin-1Epilepsy/physiopathol

ABSTRACTUsing audiogenic epilepsy prone rat P77PMC matched with epilepsy-resistant Wistar rat, we systematically studied the effects of NMDA receptor-I (NR-1) and interleukin-1 (IL-1) on the pathogenesis of epilepsy. Experiments were conducted in vivo, in brain slice, neuronal cell cultures, and at molecular levels. Some meaningful results were summarized as follows:(1) In P77PMC rat brain, NR-1 gene expression during development, and NMDA receptor activity (MK-801 binding) in adult rat were higher than that of control. After seizures, in adult P77PMC rat brain, NR-1 mRNA expression showed time-dependently up-regulation, above the basal level 111%－202% at 24hours. Intracerebral ventricular (i.c.v) injection of NR-1 antisense oligonucleotide (10μg per μl) significantly reduced P77PMC rat audiogenic seizure severity. Pretreatment NR-1 oligonucleotide (2μmol^．L^－1) to neuronal cell cultures, inhibited neuronal glutamate damage. So we considered NR-1 participated in seizure pathogenesis, and closely related to the seizure susceptibility of P77PMC rat.(2) IL-1β can dose-dependently (1－25U^．ml^－1) increase NR-1 mRNA expression, and augment NR-1 activity in neuronal cell cultures; IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) can reverse the effects of IL-1β. SoIL-1 acts as an excitatory neuromodulator, may be due to its direct or indirect effects on increasing NR-1 gene expression and NR function of the brain.(3) Using defective herpes simplex virus-1 (HSV-1) vector pHSVLac(kindly donated by Dr. Geller, Harvard University) successfully constructed recombinant pHSV-IL-1ra vector, to study experimental transgenic expression of IL-1ra. I.c.v. injection of pHSV-IL-1ra pseudovirus (5×10⁵pfu) can significantly inhibit seizure attacks of P77PMC; the transgenic expression of IL-1ra mRNA and protein in related brain regions can be maintained longer than 6 weeks.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:194-196)

国内外对癫痫发病相关因素的研究很多，重点为脑内兴奋与抑制的失衡，可以谷氨酸、γ-氨基丁酸及其受体为代表。对NMDA受体在脑发育、各种惊厥的发生发展、惊厥后神经可塑性调节、长程电增强形成等方面的作用已逐步由各种研究结果证实。但对以下问题尚少有研究报道：（1）NMDA受体活性及数量的改变与癫痫发生发展的因果关系；（2）遗传性癫痫易感动物发育中及惊厥前脑内的NMDA受体状态的研究；（3）在同一种癫痫动物模型，同时研究NMDA受体基因表达与受体功能；（4）利用反义NMDA受体寡核苷酸技术研究癫痫发生发展相关因素；（5）NMDA受体与其它相关因素同时研究。在我们既往的工作中^［1］，也提出一些亟待深入的问题：（1）遗传性癫痫易感大鼠大脑皮层神经元对外源性NMDA更敏感，可诱发更高的c-fos mRNA表达，可见癫痫易感大鼠脑内NMDA受体必具备其特点；（2）白细胞介素-1(IL-1)可促进脑内［Ca^2＋］i的水平，并可通过c-fos/c-Jun调控兴奋性神经调质阿片肽的分泌。因此深入研究NMDA受体和IL-1各自在癫痫发生发展中的作用及二者间的相互作用是有意义的。

基于兴奋性氨基酸NMDA受体活性及表达增高是神经元兴奋性损伤及癫痫发病机制的关键环节，我们以听源性癫痫易感大鼠为模型，从发育、惊厥前后等不同阶段，在大鼠的整体水平及其脑片、各区域脑组织、大脑皮层神经元培养等不同水平(均严格配以正常对照)，以惊厥的行为分级、脑片神经元放电、mRNA表达水平等为主要参考指标作了如下探讨，(1)遗传性癫痫易感动物模型NMDA受体亚单位I(NR-1)在发育中脑内基因表达规律，以阐明NR-1与癫痫易感性形成的相互关系；(2)对惊厥前，惊厥后即刻，惊厥后不同时间NR-1基因表达及NMDA受体功能进行研究，以探讨NR-1在惊厥产生中的作用，了解惊厥如何调控NR-1基因表达及其受体功能，明确NR-1与惊厥发生和发展的相互关系，及其与癫痫易感性保持的关系。(3)反义NR-1作用机制：是否抑制NMDA受体 mRNA的转录与翻译？是否降低受体功能？从而揭示反义NR-1作用途径及环节。(4)研究IL-1与神经细胞兴奋性的关系，明确它的调质性质，阐明它在癫痫等惊厥性疾病中的具体作用机制，IL-1与NMDA受体相互关系以及白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)是否具有降低神经细胞兴奋性的作用；并将其基因通过病毒载体导入培养中的大脑皮层神经细胞和惊厥易感大鼠脑内，观察神经细胞兴奋性及大鼠惊厥程度的变化，进一步明确内源性IL-1与兴奋性毒性神经系统疾病的关系。

1有关癫痫易感与不易感大鼠脑内NMDA受体的研究

1.1发育中脑内NR-1 mRNA的表达

以Northern印迹杂交方法比较发育中遗传性癫痫易感大鼠P77PMC和癫痫不易感大鼠Wistar不同脑区NR-1基因表达特点，探讨其与惊厥易感性的关系。结果证实，两系大鼠发育中，大脑皮层、海马、下丘3个脑区的NR-1 mRNA表达趋势一致，并有共同规律，即出生后表达量逐渐增加，在发育的某一阶段达高峰，成年下降并稳定于某一水平；在整个发育过程中，P77PMC大鼠脑内NR-1 mRNA的表达量高于Wistar大鼠，并在某一阶段显著增高^［2］。由此提示发育中P77PMC大鼠脑内NR-1基因表达增高可能是造成P77PMC大鼠“低惊厥阈值”及对听源性惊厥易感的原因之一。

1.2惊厥前后脑内NR-1 mRNA的表达

以遗传性癫痫易感大鼠P77PMC为研究对象，通过Northern印迹杂交检测NR-1 mRNA在惊厥后不同脑区表达，结果显示：P77PMC大鼠惊厥后大脑皮层、海马、皮层下、下丘NR-1 mRNA表达呈时间依赖性增加，4个脑区NR-1 mRNA惊厥后24 h较惊厥即刻分别增加了111%、113%、165%、202%。提示NMDA受体亚单位受惊厥活动控制，并参与惊厥的发生、发展及惊厥后突触结构的重建^［3］。我们又用原位杂交技术探讨了遗传性癫痫易感大鼠P77PMC惊厥后不同时间NR-1基因表达情况，证明大脑皮层、海马齿状回、CA1、CA2、CA3及下丘NR-1 mRNA表达呈时间依赖性增加，下丘在惊厥后2 h即出现NR-1 mRNA高表达，而大脑皮层和海马各区至24 h达高峰^［4］。听源性惊厥后这些区域NR-1 mRNA表达的上调可能与神经网络兴奋性增高及癫痫易感性的保持有关。相反，惊厥后脑中NR2A、NR2B mRNA表达却呈下调趋势，提示了下一步的研究内容。

1.3脑内NMDA受体功能的研究

我们以³H-MK-801在NMDA受体激动剂作用下与突触膜结合情况，检测了遗传性惊厥易感大鼠P77PMC脑内的NMDA受体功能。结果显示1×10^－6mol^．L^－1谷氨酸或1×10^－6mol^．L^－1谷氨酸加1×10^－6 mol^．L^－1甘氨酸可促进P77PMC大鼠大脑皮层、海马突触膜对³H-MK-801的结合，并显著高于对照。一些抗痫药及生物制剂可降低或促进