［摘要］ 目的:评价细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)治疗白血病合并丙型病毒性肝炎患者的有效性及安全性。方法:采用血细胞分离机大量采集患者的外周血单个核细胞，再用抗CD3单抗、白细胞介素2、干扰素γ培养10 d左右，然后将细胞洗涤后经静脉回输给患者。结果:12例患者在CIK治疗后其血清HCV-RNA均有一段时间转阴，其中7例持续转阴至报告时（观察时间为7～56个月），2例持续转阴6个月后因难治性白血病死亡。CIK治疗后，6例患者肝功能（ALT和/或BIL）均有明显改善；另6例肝功能持续正常。CIK输注后除一过性发热，畏寒、疲乏外，无其它严重副作用。结论:自体CIK 细胞治疗具有明显抑制甚至清除白血病患者合并丙型肝炎病毒感染的作用，可明显改善患者的肝功能，静脉输注安全。

［中图分类号］ R733.71［文献标识码］ A

［文章编号］ 1000-1530（2000）03-0251-05

First report of the effect of auto-cytokine induced killers

on HCV infection in the patients with leukemia

TONG Chun-Rong，LU Dao-Pei

（Cellular Therapy Center, Peoples' Hospital, Peking University, Beijing100044, China）

GENG Yan-Biao，JIANG Qian

（Institute of Hematology, Peking University）

ABSTRACTObjective: To evaluate the safety and therapeutic effects of auto-cytokine induced killers(CIKs) on hepatitis C virus infection in the patients with leukemia. Methods: The patients' peripheral blood mononuclear cells were collected with blood cell separator, then cultured in the medium containing monoclonal antibody against CD3， interleukine-2 and interferon-γ for about 10 days in vitro， finally washed twice and transfused back to the patients themselves. Results: HCV-RNA in the sera from all 12 patients converted negative for a period after CIK transfusion, of whom, 7 continued negative till now (7～56 months), 2 continued negative for 6 months and then died from refractory leukemia. After CIK transfusion, 6 cases' liver function (ALT and/or BIL) got much better, and the other 6 cases' continued normal. Except temporal fever, chill, fatigue etc, no severe side effects happened during or after auto-CIKs transfusion. Conclusion: Auto-CIK transfusion intravenously can inhibit or even clear HCV in the patients with leukemia, and obviously improve the patients' liver function. It is safe.

KEY WORDSAcute leukemia/ther; Cytokine induced killer; Hepatitis C/ther▲

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer, CIK）是外周血淋巴细胞经抗CD3单抗（monoclonal antibody against CD3, MabCD3）、 白细胞介素-2(interleukine-2, IL-2)和干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)体外刺激、培养、扩增出来的杀伤细胞^［1，2］。我单位临床前的研究显示白血病患者自体CIK细胞具有杀伤自体及异体白血病细胞，清除白血病标志细胞的作用。在治疗白血病的初步临床试验中，我们首次发现自体CIK可明显抑制甚至清除白血病患者血清的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV），患者的肝功能不但没有加重，反而明显改善。现将自体CIK治疗白血病合并HCV感染患者的效果报告如下。

1资料与方法

1.1研究对象

1995年8月至2000年4月期间，本单位共收治12例各类急性白血病患者，年龄14～63岁，均接受了反复化疗或(和)造血干细胞移植治疗。患者均在初始化疗中多次输注血液（或血液制品），一段时间后其血清HCV-RNA为阳性。在CIK治疗前1个月内，HCV-RNA仍然阳性。11例患者在输血（或血液制品）一段时间后出现肝功能异常，常在化疗后恶化，经多种保肝药物治疗。在接受第1疗程CIK治疗前，6例患者的肝功能正常或接近正常，另6例患者的肝功能有不同程度的异常。病原检测由北京大学肝病研究所完成，HCV-RNA采用逆转录-套式-聚合酶链反应方法（RT-nested-PCR）检测，抗-HCV采用雅培公司的ELISA试剂盒检测。

1.2自体CIK细胞的培养

每疗程用血液细胞分离机（COBE公司的Spectrum2991型或Baxter 公司的CS3000plus型）采集患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMNC）0.5×10⁹～6×10⁹。细胞培养在超洁净实验室（good laboratory practice, GLP）进行，所有可能开放的操作均在百级超净台内进行。用RPMI 1640培养液（Gibco）洗涤细胞2次, 将细胞悬浮于透气性培养袋(Baxter)中，前8例患者的细胞悬浮于RPMI 1640完全培养液中,含10%(体积分数)人AB型血清(北京市血液中心)、Hepes 25 mmol·L^－1、左旋谷氨酰胺2 mmol·L^－1；后4例的细胞悬浮于治疗级AIM-V无血清培养液（Gibco）中。调整细胞浓度为每毫升1×10⁶，并加入 IFN-γ( 上海克隆生物高技术公司) 2000IU·ml^－1，IL-2 ( 瑞得合通药业股份有限公司) 1000 IU·ml^－1及MabCD3（古巴分子免疫中心）50μg·L^－1。将细胞置于37℃，5%(体积分数)CO₂条件下培养。以后每3～4 d用培养液调整细胞浓度至每毫升1×10⁶，并加入IL-2 1000 IU·ml^－1。

1.3CIK细胞的输注及IL-2治疗

CIK培养至10 d左右时，如细菌霉菌培养阴性、活细胞＞95%，分2 d收集细胞回输给患者。先将细胞悬液离心去上清后，再用2 g·L^－1白蛋白(上海莱氏血液制品公司) 及IL-2 100 IU·ml^－1的生理盐水洗涤2次，最后将细胞悬浮于400 ml白蛋白(20 g·L^－1)及IL-2 (1×10⁶ IU)的生理盐水中，通过输血器经静脉回输给患者。后9例患者在回输CIK后次日接受IL-2 5×10⁵ ～1×10⁶ IU·d^－1，皮下注射，共5 ～10 d。

1.4细胞免疫表型及细胞内因子的检测

细胞免疫表型的染色：采用荧光标记的单抗（COULTER International Immunotech）进行染色，每一反应管加入5×10⁵细胞或全血100μl，再按试剂生产厂家的要求加入单抗，阴性对照管不加抗体，4℃避光作用30 min。如为全血，加入红细胞裂解液作用后离心去上清。用PBS洗涤2次后再加10 g·L^－1多聚甲醛固定，4℃避光保存，1周内上机检测。

细胞内因子的染色：每一反应管加入1×10⁶细胞，再按试剂生产厂家的要求加入FITC标记的抗CD4或CD8单抗，阴性对照管不加抗体，4℃避光作用30 min。用PBS洗涤1次后，加入固定及穿孔液、PE标记的抗IFN-γ或IL-10单抗（Pharmingen），阴性对照管加入与抗IFN-γ或IL-10单抗同型的PE标记鼠抗体，4℃避光作用30 min。用PBS洗涤2次后再加10 g·L^－1多聚甲醛固定，4℃避光保存，1周内上机检测。

上机检测：用Beckon Dickinson公司的FCSsort型流式细胞仪，488 nm激发光谱检测细胞，用Cell Quest软件分析数据。利用前向角光散射及侧向角光散射选择单个核细胞群进行分析，再用阴性对照管设定荧光阳性界限。反应管细胞的阳性值减去阴性对照管的阳性值即得反应管细胞的测定值。

1.5HCV-RNA的检测

由北京大学肝病研究所完成，采用RT-nested-PCR方法，其引物由该所按Okamoto^［3］报道的序列合成。

1.6临床监测指标

所有临床观察及监测均在人民医院的门诊或病房进行，血液生化指标、尿常规检测由人民医院检验科完成。

毒性反应监测： 在回输CIK过程中及回输后每天观察出现的毒性反应，直至毒性反应消失或接受其它治疗。观察项目及分级参照世界卫生组织规定的急性及亚急性毒性反应标准。

疗效监测：回输CIK前、后观察患者异常症状体征(如食欲下降、厌油、黄疸、肝大)，血白细胞分类、免疫学标志、肝功能等指标，直至患者接受其它治疗。CIK回输后每个月检测HCV-RNA 1次；如连续2次获得相同的结果且已停化疗，每3～6个月再检测1次； 持续阴性1年以上且不再化疗者，每6～12个月再检测1次。

2结果

2.1CIK的培养及免疫标志分析

每次采集的细胞培养后回输为1疗程。12例共接受22疗程CIK治疗，其中1例接受4疗程治疗，3例接受3疗程治疗，1例接受2疗程治疗，7例仅接受1疗程治疗。每疗程回输的CIK总数为5×10⁹～22.8×10⁹（表1）。

5例患者细胞培养前、后的免疫标志变化见表2。CIK中的主要细胞为CD3⁺及CD8⁺细胞, 大多数患者分别达到90%、65%以上；在不同患者的CIK细胞中CD3⁺、CD8⁺细胞也是变化较为一致的细胞群。CD3⁺