摘要目的：验证重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)双体融合分子(G2)较GM-CSF单体分子具有高活性的结构机制。方法：利用Insight II软件，采用同源性模建结合手工拼接的方法模建出G2融合分子的空间三级结构，并将其与GM-CSF单体的结构相比较。结果：模建出的G2融合分子前后两个结构单元在空间位置上相对独立，二者各自的三级构象及二级结构组成均与GM-CSF非常相似。另外，从受体结合位点的分析结果来看，G2分子在结构上有能力同时结合两分子的GM-CSF受体。结论：G2融合分子中的两个GM-CSF结构单元在结构上基本保持了GM-CSF单体分子的三级结构，其空间结构允许两分子的GM-CSF受体同时结合，引发受体间的交联，从而产生高活性。

中国图书资料分类法分类号R73-3

Modeling for the three dimensional structure of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor homodimmer fusion protein

RAO Yan, GU Wei-Feng, MA Da-Long

(Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083)

MeSHGranulocyte-macrophage colony-stimulating factorProtein structure, tertiaryGene rearrangementRecombinant fusion protein

ABSTRACTObjective: To elucidate the structural mechanism for which recombinant human GM-CSF homodimmer fusion protein(G2) exhibits about ten-fold higher bioactivity than GM-CSF monomer.Methods: Homology modeling with Insight II software combined with manual linking.Results: From the modeled structure, it could be seen that the upstream and the downstream GM-CSF structural domains of G2 were relatively independent in spatial position. Also, both of the two domains presented very similar three-dimensional conformation and secondary structure composition to those of GM-CSF monomer. In addition, the result of receptor binding sites analysis suggested that G2 had the structural capability to bind two GM-CSF receptors simultaneously.Conclusion: The two GM-CSF structural domains of G2 fusion protein retained the original basic tertiary structure of GM-CSF monomer. G2 has the capability to bind two GM-CSF receptors simultaneously and to induce the linkage between two receptors, which might explain its remarkably elevated bioactivity.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:387-390)

人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)在肿瘤放化疗后的辅助治疗中有重要意义。我室曾利用基因重组的技术成功地在大肠杆菌表达了重组人GM-CSF双体分子(G2)，发现 G2具有高于GM-CSF单体分子10倍的刺激TF-1细胞增殖的活性^［1］。本文在此基础上，利用同源性模建结合手工拼接的方法，模建出了G2分子的空间三级结构，并且从结构上证明了G2分子有可能同时结合两分子的GM-CSF受体，引发受体间的交联，从而表现出高活性。

1材料与方法

1.1主要材料

O2计算机工作站，SGI公司生产；工作软件Insight II(MSI/BIOSYM公司)，其中使用模块homology，discover，biopolymer，analysis，viewer。

1.2分子模建过程

1.2.1linker区域的构象搜索

G2的linker序列主要来自于人IL-3的N端14个氨基酸^［1］，根据linker区肽段的一级序列，得到单个残基构象完全舒展的linker区的结构。

利用分子动力学模拟搜索linker区的构象：在310K的温度下，进行35ps的模拟，从5ps开始，每间隔一段时间取一个时间点的构象，共取了5ps，10ps，15ps，30ps，35ps等5个构象。

1.2.2G2融合蛋白的结构模建

手工拼接出G2的空间构象：根据GM-CSF单体的结晶三级结构信息^［2］，利用手工拼接的方法使前一个GM-CSF结构单元的C-末端残基Ser与linker的第一位残基Tyr及linker最后一位残基Val与后一个GM-CSF结构单元的第一位残基Ala形成omega=±180°的肽键。模建时选用30ps处的linker区构象。

对G2进行分子力学优化：设定forcefield为amber进行分子力学优化：先对侧链原子进行优化；一些固定参数设定为：dielectric=4.0，dist-dependent=On，scale-terms中P_1－4=0.5。之后再对骨架原子进行力学优化。

对G2进行分子动力学模拟：先对侧链原子进行模拟，再对全部原子进行15ps的模拟。

再次对G2分子进行分子力学优化：先对侧链原子进行优化，再逐渐对主链原子进行优化，最后整个分子系统的rms derivative=0.000 97

2结果

linker区的模建结果见图1。

图1linker区域在动力学搜索过程中5 ps，10 ps，15 ps，30 ps，35 ps等5个时间点处的构象

Figure 1different conformations of linker segment at 5 ps，10 ps，15 ps，30 ps，35 ps time points during dynamics simulation

G2融合分子的三级结构模建结果见图2。

图2G2分子的三级结构模建结果

Figure 2Modeling result for the three-dimensional structure of G2 fusion protein

G2分子模建结果的一般特性及参数：

G2分子总表面积＝13756.17A²

极性表面积/非极性表面积＝0.94

通过与GM-CSF单体分子的三级结构重叠结果显示，前一个GM-CSF结构单元与GM-CSF分子在三级结构上的偏差为rms derivative=1.99；后一个GM-CSF结构单元与GM-CSF分子的空间结构上的偏差为RMS derivative=1.38。

通过Kabsh-sander法则^［3］确定G2的二级结构组成与hGM-CSF的二级结构组成比较(表1、2)。

表1G2与GM-CSF的α-螺旋组成比较及相应部分结构偏差分析

Table 1Comparison of alpha-helices composition between G2 and GM-CSF and analysis of structural difference

α-helices 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 G2 Trp13-

Asn27 Ala33-

Asn37 Gln56-

Gln64 Lys74-

His87 Phe103-

Leu115 Trp156-

Asn170 Ala176-

Asn180 Leu198-

Gln207 Lys217-

Ala224 Tyr227-

His230 Phe246-

Val259 GM-CSF Trp13-

Leu28 Ala33-

Asn37 Leu55-

Gln64 Lys74-

His87 Phe103-

Val116 Trp156-

Leu171 Als176-

Asn180 Leu198-

Gln207 Lys217-

His230 Lys217-

His230 Phe246-

Val259 rms

derivative 0.328 0.215 0.422 0.367 0.577 0.650 0.221 0.333 0.861 0.861 0.665

表2G2与GM-CSF的β-片层组成比较

Table 2Comparison of β-sheets composition between G2 and gM-CSF

β-sheets 1 2 3 4 G2 Thr39-Ile43 Thr98-Thr103 Thr182