摘要目的：比较胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)对高浓度葡萄糖的腹膜间皮细胞毒性作用的影响。方法：体外培养人腹膜间皮细胞，在上清中加入83.3 mmol^.L^－1葡萄糖和不同浓度IGF-1或EGF，培养24、48和72 h后，测定³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)掺入率和上清中乳酸脱氢酶(LDH)水平。结果：50μg^.L^－1的IGF-1作用72 h后，83.3 mmol^.L^－1葡萄糖溶液中培养间皮细胞的³H-TdR掺入率较高糖抑制组增加(75±15)%(P＜0.01)，作用24h，上清中LDH水平较高糖抑制组减少(34±8)% (P＜0.01)；EGF对高糖细胞毒性无明显影响(P＞0.05)。结论：IGF-1能拮抗高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞的毒性作用。

中国图书资料分类法分类号R587

The effect of insulin-like growth factor-1 on the cytotoxicity of high concentration glucose to human peritoneal mesothelial cells

TANG Zi-Yong^#, FAN Min-Hua, ZOU Wan-Zhong

(#Department of Nephrology , the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing100083)

MeSHInsulin-like growth factor-1/pharmacolPeritoneal mesothelial cells^☆Glucose/tox

ABSTRACTObjective: To compare the effect of insulin-like growth factor-1(IGF-1) and epidermal growth factor (EGF) on the cytotoxicity of high concentration glucose to human peritoneal mesothelial cells (HPMCs).Methods: Human peritoneal mesothelial cells were cultured in vitro, and different concentration of IGF-1 or EGF was added to HPMCs that was cultured in RPMI 1640 medium containing 83.3 mmol^.L^－1 glucose. After 24, 48 and 72 hours, the incorporation of³H-thymidine (³H-TdR) and the concentration of lactate dehydrogenase(LDH) in supernatants were detected.Results: The addition of 50μg^.L^－1 of IGF-1 to 83.3 mmol^.L^－1 glucose caused a (75±15)% increase in³H-TdR incorporation for 72 hours (P＜0.01), and a (34±8)% decrease in release of LDH for 24 hours (P＜0.01). EGF had no significant influence on the cytotoxicity of high glucose to HPMCs.Conclusion: IGF-1 can reverse the cytotoxicity of high glucose to HPMCs.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:51-54)

腹膜间皮细胞是构成腹膜的重要细胞群体，在保持腹膜结构完整和功能正常中起着重要作用。研究表明，腹膜透析液中的高浓度葡萄糖是非生物相容性的主要因素，对腹膜间皮细胞有明显毒性作用，通过抑制间皮细胞的增殖而干扰其脱落后的再修复过程，间皮细胞丧失是腹膜硬化发生和发展的始动环节。因此， 寻找拮抗高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞毒性作用的方法，对预防腹膜硬化、延长腹膜透析寿命具有重要意义。

胰岛素样生长因子及其受体在细胞生长、分化和损伤后的再修复过程中发挥着重要作用。有人发现，人腹膜间皮细胞上存在胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor, IGF-1)受体，IGF-1在体外能促进腹膜间皮细胞的增殖^［1］。人腹膜间皮细胞上也存在表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)受体^［2］。本实验建立了人腹膜间皮细胞体外培养模型，比较IGF-1和EGF对间皮细胞的生长促进作用以及两种生长因子对高浓度葡萄糖细胞毒性作用的影响。

1材料与方法

取择期腹部手术病人的大网膜切除标本(n=6)，体外培养人腹膜间皮细胞，同文献［3］方法。大网膜在含1.25g^.L^－1胰蛋白酶、0.1g.L^－1EDTA、1 g^.L^－1葡萄糖的消化液中，37℃消化20 min，细胞沉淀以含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI 1640培养液(Sigma) RPMI重悬，接种入30cm²、明胶包被的培养瓶，于细胞培养箱中培养，每3天换一次培养液。传代时用含0.5g^.L^－1胰蛋白酶、0.2g^.L^－1EDTA的消化液。以倒置显微镜、透射电镜检查,免疫组织化学染色鉴定，免疫组织化学染色采用LSAB法，分别作抗人cytokeratin 和抗人vimentin两种染色。体外培养传代的第3代细胞用于实验。

1.1间皮细胞增殖试验

用10%(体积分数)胎牛血清培养液制成1×10⁵ml^－1细胞悬液，加入96孔细胞培养板，每孔100μl。分组：正常对照组；高糖抑制组，含不同质量浓度的葡萄糖；IGF-1刺激组和EGF刺激组，含不同质量浓度的IGF-1或EGF；IGF-1拮抗组和EGF拮抗组，在83.3 mmol^.L^－1葡萄糖溶液中分别加入不同质量浓度的IGF-1或EGF^［1，2］。分别培养24、48、72 h，培养结束前6h，每孔加入1.85×10⁴ Bq的

³H-TdR。收集细胞，液体闪烁yf 数仪测弱β放射性。

1.2间皮细胞损伤试验

同上的1×10⁵ml^－1细胞悬液，加入24孔细胞培养板中，每孔500 μl。分组：高糖抑制组，含不同浓度葡萄糖；IGF-1拮抗组和EGF拮抗组，在83.3 mmol^.L^－1葡萄糖溶液中加入不同质量浓度IGF-1或EGF；对照组为无血清培养。分别培养24、48和72h后，培养结束时收集上清，于全自动生化分析仪上速度法测LDH水平。

1.3统计学方法

以上实验均作4个平行孔，取平均值，计算实验值占正常对照的百分数，计对照为100%。同一实验重复6次，结果以±s表示。先作单因素方差分析，再作非配对组间t检验。

2实验结果

2.1人腹膜间皮细胞体外培养的鉴定

倒置显微镜下，细胞汇合后呈密集的铺路卵石样生长。透射电镜下：细胞表面存在大量多少不等、较长的微绒毛。符合腹膜间皮细胞的形态及超微结构特点。免疫组织化学染色结果显示，培养细胞对人cytokeratin和vimentin的反应均为阳性，细胞纯度大于97%。这种双阳性信号只见于间皮细胞，排除了纤维母细胞和上皮细胞污染的可能。另外，可能污染的细胞还有红细胞、白细胞、肥大细胞等，但都不能在体外长时间生存。因此，所培养细胞为高纯度的人腹膜间皮细胞。

2.2高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞的毒性作用

浓度大于55.6 mmol*L^－1的葡萄糖溶液作用48 h以上可明显抑制腹膜间皮细胞的增殖能力。随着葡萄糖浓度的增加和培养时间的延长，³H-TdR掺入量减少（表1）。浓度大于55.6 mmol*L^－1的葡萄糖溶液即可使腹膜间皮细胞培养上清中LDH水平明显增加(表2)。

表1不同浓度葡萄糖对间皮细胞³H-TdR掺入量的影响

Table 1Influence of different concentration glucose

on³H-TdR incorporation of normal HPMCs

／％^▲

c(glucose)/

mmol^.L^－1 t/h 24 48 72 27.8 100±11 101±12 96±12 55.6 95±9 76±9^* 68±8^** 83.3 68±6^** 50±8^** 40±5^** 138.9 33±5^** 21±4^** 6.7±1.2^** 236.1 12.5±2.1^** 6.9±0.9^** 2.43±0.24^**

▲percentage of normal control; *P＜0.05， **P＜0.01 vs normal control (100%).

表2不同浓度葡萄糖对间皮细胞培养上清中LDH水平的影响

Table 2Influence of different concentration glucose

on LDH level in HPMCs' supernatant

／％^▲

c(glucose)/

mmol^.L^－1 t/h 24 48 72 27.8 30±7