摘要目的：选用合适的质粒表达载体,以多拷贝基因的形式在大肠杆菌中高效表达人α心钠素, 为人α心钠素的下游纯化工作及基因工程菌的中试打下基础。方法：采用PCR，克隆及连续亚克隆，序列分析，原核温度诱导表达等方法。结果：PCR方法扩增α-hANP基因,克隆至原核表达载体pMS31b，热诱导表达融合蛋白。结论：在大肠杆菌中获得了人α心钠素的高表达。

中国图书资料分类法分类号R343.11

Expression of α-human atrial natriuretic peptide from

multi-jointed genes in Escherichia coli

ZHAO Ming, MA Kang-Tao, ZHANG Nai-Heng

(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Beijing Medical University, Beijing100083)

MeSHAtrial natriuretic factor/mietabmulti-jointed^☆Escherichia coliGene amplification

ABSTRACTObjective:To express α-hANP from multi-jointed genes in E.coli by selecting the proper plasmid vector and to lay the basis for the down-stream purification and the middle scale production of the high level expression engineered strains.Methods: PCR, gene cloning and successive sub-cloning, DNA sequencing, prokaryotic temperature induction, etc.were used.Results: α-hANP gene was amplified by PCR, cloned to prokaryotic expression vector pMS31b, and the fusion protein was temperature-induced.Conclusion: High level expression of α-hANP was obtained.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:20-22)

当前临床已试用人α心钠素( atrial natriuretic peptide，α-hANP)治疗充血性心衰、原发性高血压、肾功能不全等疾病,并已取得显著疗效^［1］。由于28肽的人α心钠素结构简单，仅在Cys7与Cys23之间形成一个链内二硫键，没有生物学活性所必需的糖化、脂化位点，这使其在大肠杆菌系统中表达成为可能^［2］。

1材料与方法

1.1材料

表达载体pMS31b及宿主菌E.colipop2136均为本校免疫学系马大龙教授惠赠。人α-心钠素cDNA、质粒pUC18及E.coliJM109为本室保存。DNA引物由赛百盛公司合成。

1.2目的基因的克隆及序列分析

以人α-心钠素cDNA为模板，两条引物设计分别含有EcoRⅠ、NsiⅠ、PstⅠ及HindⅢ酶切位点。

5′GCG GAATTCATGCAT TGG AGTCTACGAAGATCT3′,5′GCGG AAGCTT TTA CTGCAG CCA GTATCGAAAGC-TGTT 3′。PCR反应条件及产物回收按文献［3］进行。将经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后的PCR产物克隆至测序载体pUC18中，转化E.coli JM109，得到重组质粒pUC18-ANP。由于NsiⅠ与PstⅠ的粘端互补性，可用NsiⅠ和HindⅢ切出100 bp的ANP部分， 插入到pUC18-ANP的PstⅠ/HindⅢ位点之间，得到重组质粒pUC18-2ANP。利用自动测序仪对pUC18-ANP及pUC18-2ANP的插入部分进行核苷酸序列分析。

1.3系列表达载体的构建

pMS31b是一个高效原核表达载体，融合有100个氨基酸的MS₂片段。利用EcoRⅠ/HindⅢ将pUC18-ANP、pUC18-2ANP中的ANP及2ANP部分插入到pMS31b的多克隆位点，构建成功表达载体pMS-ANP和pMS-2ANP。通过连续亚克隆技术构建系列表达载体pMS-3ANP、pMS-4ANP、pMS-5ANP、pMS-6ANP、pMS-7ANP、pMS-8ANP。酶切图谱如图1。

1，DNA marker； 2，PCR product； 3-10，pMS-nANP was digested with EcoRⅠ and HindⅢ.

1PCR产物分析以及pMS-nANP的酶切鉴定(15 g^.L^－1琼脂糖胶电泳)

Figure 1PCR product analysis and identification of pMS-nANP

by endonuclease digestion on 15 g^.L^－1 agarose gel

1.4融合蛋白的诱导表达

pMS31b含有P_L启动子，转化菌E.coli pop2136含有cI857基因。30℃时cI阻遏蛋白抑制P_L启动子的转录，42℃时cI阻遏蛋白失活，转录进行，表达融合蛋白。转化菌于30℃生长至D₆₀₀为0.4～0.6,转至42℃诱导4h，表达目的蛋白。

1.5融合蛋白的活性测定

8 mol^.L^－1尿素变性溶解包涵体后，在谷胱甘肽存在下，利用复性缓冲液直接稀释使融合蛋白复性。取离体大鼠主动脉，先加去甲肾上腺素使之收缩，再给融合蛋白测定其舒张血管活性^［4］。

2结果与讨论

以人全长αANP cDNA为模板，用α-hANP特异引物进行PCR扩增，得到一条约为100 bp的片段。以EcoRⅠ和HindⅢ酶切后克隆至表达载体pMS31b中。序列测定结果表明所扩增出的DNA片段与预期相符，证明所挑选的阳性克隆经PCR反应后无突变发生。利用NsiⅠ与PstⅠ的粘端互补性构建系列表达载体pMS-3ANP、pMS-4ANP、pMS-5ANP、pMS-6ANP、pMS-7ANP、pMS-8ANP。重组质粒pMS-nANP用EcoRⅠ和HindⅢ双切后，可切出ANP到8ANP8个片段，形成一个从小到大的DNA ladder，大小依次为111、207、303、399、495、591、687和783 bp。

融合蛋白的诱导表达:SDS-PAGE显示, 表达的多串心钠素与MS₂融合蛋白相对分子质量分别为(1)MS2-ANP 15 000；(2)MS₂-2ANP 18500;(3)MS₂-3ANP 22000;(4)MS₂-4ANP 25500。其中菌体蛋白MS₂为100氨基酸，约11000。蛋白电泳显示(图2)，随着插入外源基因的加大，pMS-ANP到pMS-4ANP的表达量呈明显的下降趋势(分别占全菌总蛋白的30%、25%、22%和8%)，pMS-5ANP，pMS-6ANP、pMS-7ANP及pMS-8ANP则未见表达。可见，α心钠素是一种E.coli不喜的难表达的真核生物蛋白。超声破菌后，收集包涵体与上清，SDS-PAGE分析，融合蛋白全部以包涵体的形式存在，其纯度可达50%～60% 。变性及复性条件下纯化的初步结果表明(未示)，融合蛋白基本为一碱性蛋白，且随着心钠素拷贝数的增加，其等电点逐渐升高。阳离子交换柱应是首选，再配合凝胶过滤或疏水层析，应能得到高纯度的融合蛋白。对复性后产物的活性测定结果表明，融合蛋白能引起预先收缩的大鼠主动脉条舒张，具有很好的生物学活性。

1-4， expression of pMS-4ANP, pMS-3ANP, pMS-2ANP, pMS-ANP；

5， control of host strain E.colipop2136； 6， protein marker．

2pMS-nANP在E.colipop2136中的诱导表达

Figure 2Expression of pMS-nANP in E.colipop2136

为便于多串心钠素的裂解，在紧接ANP编码序列的上、下游分别引入一个色氨酸密码子TGG。融合蛋白中的菌体蛋白MS₂部分仅为100个氨基酸，且不含色氨酸，在ANP-28氨基酸中恰好也不存在色氨酸残基，为纯化后使用特异的色氨酸裂解剂切割多串心钠素提供了可能。现已有多种化学试剂可以裂解色氨酸肽键，以得到ANP单体，进一步工作正在进行中。

心钠素在机体内含量极低, 人工合成多肽成本较高, 基因工程技术以其极大的优越性成为生产心钠素的首选方法。但由于α心钠素仅为28肽，对于基因工程方法生产难度很大，以前国内外报道在酵母和大肠杆菌中表达，产量很低，纯化困难。本文利用多拷贝的形式表达，大大提高了产量，为下游工作打下了基础。

☆自由词。

参考文献

1Nakao K, Itoh H, Saito Y, et al. The natriuretic peptide family. Curr Opin Nephrol Hyperten, 1996,5:4-11

2Wilkinson DL, Ma NT, Haught C, et al. Purification by immobilized metal affinity chromatography of human atrial natriuretic peptide expressed in a novel thioredoxin fusion protein. Biotechnol Prog, 1995,11:265-269

3Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. 2nd ed, New York: Cold Harbor Spring, 1989．672-684

4周永春,陆峰,金永明,等.重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子包涵体的提取、复性和纯化的研究. 生物工程学报, 1997,13(2):142-148

（1998-04-13收稿)

(本文编辑：王蕾)