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中国图书资料分类法分类号R737.31
in vitro study of the stimulative effect of ovarian cancer anti-idiotypicantibody 6B11 scFv/hGM-CSF fusion protein on immunocytes
YANG Fei-Xue, QIAN He-Nian, LIU Bei
(Gynecological Oncology Center, People's Hosiptal, Beijing Medical University, Beijing100034)
MeSHAntibodies, anti-idiotypicGranulocyte-macrophage colony-stimulating factorRecombinant fusion protein/pharmacolImmunity, cellular/drug effOvarian neoplasm/immunol
ABSTRACTObjective: To explore the possibility of an anti-idiotypic antibody/human GM-CSF fusion protein (6B11 GM) used as tumor vaccine for ovarian cancer.Methods: In vitro T cell proliferation to determine the capacity of 6B11GM to stimulating T cells; T cell phenotype and the MHC Ⅱ expression of antigen presenting cell (APC) were determined with flow-cytometry. Cytotoxity of primed mononuclear cells was investigated using trypan blue with the ovarian cancer cell line SKOV3 and the K562 as target cells.Results: Both 6B11 and 6B11 GM could stimulate special T cell proliferation, however 6B11 GM was advanced at the proliferation level. CD4+ T cells were predominate among the proliferation cells.6B11 GM could significantly enhance the MHC Ⅱ expression of APC. An in vitro non-MHC-restricted cytotoxic function could be effectively activated with 6B11 GM and 6B11. When compared with 6B11, 6B11 GM was more likely to be taken up by APC.Conclusion: 6B11 GM can stimulate cellular immunity, and therefore may be used as tumor vaccine for ovarian cancer.
(J Beijing Med Univ, 1999,31:9-12)
抗独特型疫苗作为肿瘤疫苗已用于临床，在结肠癌等肿瘤治疗中取得良好疗效。与其他疫苗相比，具有易制备、不易被肿瘤病毒污染等优点。但由于模拟的抗原表位有限，免疫原性弱。6B11是本实验室制备的模拟卵巢浆液性囊腺癌表面抗原的抗独特型抗体。在构建卵巢癌抗独特型单链抗体（6B11 scFv）的基础上，又构建了表达6B11 scFv与hGM-CSF的融合蛋白质［1］。本文对6B11 GM作为卵巢癌肿瘤疫苗的可能性进行初步探讨。
1材料与方法
抗体及细胞因子：6B11单抗及融合蛋白质6B11 GM［基因工程产品,相对分子质量(Mr)4.3×104, 其中GM-CSFMr 1.4×104］，本室制备。小鼠IgG，购自军事医学科学院。hGM-CSF， 北京医科大学免疫学系马大龙教授惠赠。
T淋巴细胞和抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)细胞的分离制备：正常自愿者2名取静脉血15 ml，加1.5 ml的20 g*L－1 EDTA抗凝，PBS等体积稀释后，加等体积的单个核细胞分离液，分离单个核细胞，培养2 h，吸取非粘附细胞，过尼龙毛柱，分离T细胞。用力吹打，吸取粘附细胞（做为APC）。
细胞系：卵巢癌细胞SKOV3(ATCC), 能与COC166-9（6B11的一抗）特异结合。宫颈癌细胞系HeLa细胞，本室保存，COC166-9阴性细胞。K562细胞，NK敏感细胞株。
淋巴细胞增殖实验：在96孔培养板上每孔加入T细胞1×105，APC1×105（30Gy照射），每孔再加6B11 GM(100μg.L－1)，6B11(100μg.L－1), 6B11(100μg.L－1)+GM-CSF(33μg.L－1),GM-CSF(33μg.L－1)或IgG(100μg.L－1)，平行3孔。（1）初次反应：37℃培养5d后，加MTT(1g.L－1)20 μl, 37℃ 4h，用酸性SDS溶解后测570 nm处吸光度(A)。（2）再次反应：37℃培养5d后，分别加入SKOV3(30 Gy高能X线照射，使用前反复冻融3次) 1×105，37℃培养过夜，加MTT(1g.L－1)20μl,37℃4h，用酸性SDS溶解后测A570。
T细胞表型分析：小鼠抗人CD3，CD4，CD8均购自中山公司，按说明书操作。
APC HLA-DR表达测定：分离APC，如前述。分别加入100 μg.L－1 6B11及6B11GM，孵育4～5d后，流式细胞仪测HLA-DR表达。小鼠抗人HLA-DR购自中山公司，按说明书操作。
6B11GM融合蛋白质对APC摄取抗原的影响：6B11sGM和6B11，分别与APC 37 ℃孵育2 h。加COC166-9，4 ℃孵育1 h后，加FITC标记的羊抗鼠IgG。上机测定荧光标记细胞数。
非MHC限制的杀伤试验和冷靶抑制试验：正常人外周单个核细胞，与IgG, 6B11, 6B11 GM及GM-CSF（浓度与淋巴细胞增殖试验同）共同孵育5 d后，收集淋巴细胞。调整细胞水平，在96孔板中加淋巴细胞5×105，SKOV3 5×103（效∶靶＝100∶1）。于8、12、16h观察细胞情况。20h后台盼蓝染色计数100个SKOV3细胞中的死细胞数(杀伤)。同时设对照孔，对照孔加K562，效靶比为40∶1（冷靶抑制），NK杀伤＝杀伤－冷靶抑制。
统计学分析：采用t检验和χ2检验。
2结果
T细胞分离：分离的T细胞经流式细胞仪测定CD3＋细胞占93％。
T细胞增殖反应：在初次反应中，6B11 GM，6B11和对照小鼠IgG刺激T细胞增殖的强度无明显区别，而当用COC166-9阳性的卵巢癌细胞株SKOV3再次刺激时，6B11 GM、6B11组T细胞增殖的幅度明显高于对照IgG及GM-CSF组，且6B11 GM组又高于6B11组而与6B11+GM组相似(图1)。而用HeLa细胞刺激时，无明显的再次增殖反应。
*P＜0.05 vs IgG group； NS，P＞0.05 vs IgG group；
▲P＜0.05 vs 6B11 group．
1体外T细胞增殖反应
Figure 1In vitro T cell proliferation primed by
the 6B11 GM and rechallenge with SKOV3
6B11 GM对T细胞表型的影响：在6B11 GM引起的T细胞增殖反应中，初次反应和再次反应均以CD4+为主(表1)。
表1增殖反应前后T细胞表型分析
Table 1The phenotypic assay of primed T cell from donors
／％
Beforestimulation Primary Secondary No.1 CD4＋ 49.4 56.8 61.5 CD8＋ 38.0 30.6 32.5 N0.2 CD4＋ 43.4 58.0 63.7 CD8＋ 33.4 37.1 31.7
6B11 GM对APC MHC Ⅱ分子表达的影响：No.1 APC HLA-DR基础表达水平30.8%,6B11组32.3%,6B11 GM组37.4%;No.2 APC HLA-DR基础表达水平38.5%, 6B11组49.0%,6B11 GM组65.2%。6B11能使APC的MHC Ⅱ表达明显增加, 6B11对APC MHC Ⅱ的表达无明显影响。
6B11 GM对APC摄取抗原的影响：与6B11＋GM-CSF组相比较，经6B11 GM孵育的细胞，能被COC166-9检测的细胞数更高，分别为54.2%和37.2%, 表明融合蛋白质更易被APC吸附摄取。
刺激后外周血单个核细胞的杀伤作用：6B11 GM和6B11，6B11刺激组单个核细胞与SKOV3孵育8 h后，出现单个核细胞包绕肿瘤细胞18 h后细胞形态不清(图2)。其余组无此现象。20 h后台盼蓝计数死细胞(表2)。
