摘要目的:观察逆转录病毒载体介导的降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)基因对人脐静脉内皮细胞的作用，探讨其应用于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄基因治疗的可行性。方法:构建含有CGRP cDNA的逆转录病毒载体，体外转染人脐静脉内皮细胞。用RT-PCR及放射免疫法分析检测基因表达水平。应用细胞计数及流式细胞仪观察CGRP基因对内皮细胞生长的影响。结果:逆转录病毒载体能有效地将外源性基因导入血管内皮细胞并稳定表达。导入CGRP基因可以促进内皮细胞的分裂增殖，从而加速损伤内皮的修复。结论:CGRP基因有可能作为动脉粥样硬化及再狭窄基因治疗的有效候选基因。

中国图书资料分类法分类号Q343.11

Expression of calcitonin gene-related peptide in human umbilical veinendothelial cells transfected with retroviral vectors in vitro

CUI Jun-Feng^＃, XU Cheng-Bin,WANG Shen-Wu,HUO Yu-Qin,JIN Xiao-Feng

(#Department of Cardiology, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing100044)

MeSHTransfectionEndothelium, vascularCalcitonin gene-related peptideUmbilical veins

ABSTRACTObjective: To investigate the effect of calcitonin gene-related peptide (CGRP) gene mediated by recombinant retroviral vector on human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) and explore the possibility of using CGRP gene for gene therapy in atherosclerosis and restenosis.Methods: CGRP gene recombinant retroviral vector was constructed to transfect into HUVEC in vitro. The gene expression was detected by radioimmunoassay and RT-PCR. The role of CGRP gene on HUVEC proliferation, viability and cell cycle were observed by cell-counting and flow cytometry, respectively.Results: The CGRP gene could be effectively transferred into HUVEC and stably expressed. The expressed CGRP gene promoted the proliferation of HUVEC and might enhance the recovery of injured endothelium.Conclusion: CGRP gene can serve as one of the promising candidate gene for gene therapy in atherosclerosis and restenosis. Retroviral mediated CGRP gene transfer may be used to treat atherosclerosis and restenosis.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:41-44)

降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是迄今发现的人体内舒血管活性最强的一种多肽^［1］。它还能抑制平滑肌细胞的增生，促进内皮细胞的修复。而血管内皮细胞损伤被认为是动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)后再狭窄等血管增殖性疾病的始发因素，因此，局部导入具有促进血管再生特性的CGRP是防治血管损伤和动脉粥样硬化引起的内膜增殖的一个很有希望的途径。本文选用重组逆转录病毒载体转染培养的人脐静脉内皮细胞，观察CGRP基因的表达及CGRP对内皮细胞表型的影响，以探索一种可能用于防治PTCA后再狭窄的治疗手段。

1材料与方法

1.1细胞培养

脐带取自北京医科大学人民医院产房，产后立即切取脐带置PBS液中4℃保存,3h内使用，按文献［2］介绍的方法操作。取1～2代细胞用于实验。内皮细胞鉴定采用von Willebrand's factor antigen,培养液用M199＋20%(体积分数)胎牛血清。传代培养时加10μg^.L^－1 ECGF(endothelial cell growth factor)和肝素5000U^.L^－1，为减少细胞代次本身的影响，每次尽可能选用相同代次的细胞进行实验。PA317及NIH3T3细胞由北京医科大学人民医院王申五研究员惠赠，培养液用DMEM+10%(体积分数)胎牛血清(简称D10,以下同)。

1.2逆转录病毒载体的构建

质粒pTT42由美国霍普金斯大学肿瘤学中心Barry Nelkin教授惠赠，含人α-CGRP cDNA 2、3、5和6外显子序列，逆转录病毒载体pLXSN由北京医科大学人民医院王申五研究员惠赠，限制性内切酶和T4 DNA连接酶为Promega公司产品，E.Coli DH5α为人民医院中心实验室保存菌种。pTT42经PstⅠ消化获得cDNA片段，亚克隆至Bluscript SK质粒的PstⅠ位点，转化大肠杆菌后挑取白色菌斑并用BstⅪ筛选正向重组子，由酶切后DNA片段大小即可判定正、反向重组体。正向重组子再经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，最后将回收的目的片段定向克隆至pLXSN的EcoRⅠ和BamHⅠ多克隆位点，扩增、纯化后进行包装。

1.3重组病毒的包装及筛选

取对数生长期的包装细胞PA317在直径60 mm培养皿中传代培养12～24 h，达50%～60%汇合。用脂质体转染试剂DOTAP(Boehringer Mannheim)将纯化后的DNA分别导入包装细胞，以含有400 mg^.L^－1 G418(Sigma) 的D10 按1∶5～1∶10(体积比)稀释，培养10～15d，G418浓度加至600～800mg^.L^－1，约3周长出细胞集落，分别转种扩大培养，收集上清，加10%(体积分数)甘油，－70℃保存。收集的上清分别以1∶10²，1∶10³，1∶10⁴(体积比)稀释，感染传代后生长24h的NIH3T3细胞，按1∶10(体积比)稀释传代，并在含G418(400～600mg^.L^－1)的D10中筛选培养，2～3周后出现细胞克隆，计数并算出病毒滴度(克隆形成单位/毫升,cfu^.ml^－1)。

1.4HUVEC(human umbilical vein endothelial cells)的基因转导

在6孔板中每孔接种2×10⁵ HUVEC, M199＋20%(体积分数)胎牛血清培养24h后移出培养液，加1ml病毒上清及polybrene 6 mg^.L^－1，转染24h后加入G418100 mg^.L^－1继续培养12d，每3～4d换液1次，以不加病毒上清及加入空载体病毒上清的细胞作为对照。

1.5基因表达的分析

取正常细胞及转导病毒的细胞各约3×10⁵，提取细胞RNA,建立反转录体系，设计的目的基因引物分别位于第5和第6外显子之间，扩增片段长度189 bp,引物序列为5′GTGACACTGCCACCTGT3′和5′CACATTAAAAGGAGTTCAGC3′，由美国Cybersyn公司合成。PCR反应条件94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 30s，共30个循环，20g^.L^－1琼脂糖凝胶电泳分析结果。

1.6CGRP蛋白的放射免疫分析

转导病毒载体的内皮细胞经G418筛选两周(100 mg^.L^－1)并维持培养，测量前一天换新鲜无血清培养基,取培养上清2ml，按文献［3］报道的方法测定，兔抗人CGRP(hCGRP)血清为 美国Peninsula Lab产品，¹²⁵I-hCGRP(1×10⁴～1.5×10⁴ min^－1)为Amersham公司产品。

1.7生长曲线的观察

分别将转导病毒载体的细胞和未转导外源基因的正常细胞按每孔3×10⁴的密度接种至24孔板，每组接种3孔，孵育24h以使细胞贴壁生长。然后用血球计数板每天计数各组细胞，每次数3孔，每孔数3次，最后取3孔的总平均数作为当日的细胞数，共计数5d。

1.8流式细胞术对细胞周期各时相DNA定量分析

取1×10⁶正常对照组细胞及转导病毒的细胞各1瓶，胰酶消化，PBS清洗，75%(体积分数)乙醇固定，RNase A(1g^.L^－1)消化，加碘化丙啶(PI,50mg^.L^－1)染色后上流式细胞仪进行DNA分析。

1.9统计分析

实验结果以±s表示,组与组之间比较采用F检验和q检验。

2结果

2.1质粒的构建及酶切鉴定

pTT42经PstⅠ消化获得约850 bp cDNA片段，正向重组子pRCGRP经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后应得到约900bp和5.822bp 2个片段,从图1可见酶切结果符合预期片段大小。

1, λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker; 2，CGRP cDNA band;

3, pTT42 digested by PstⅠ, producing two fragments of about 900bp and 4.36 kb(the first one is too faint to be seen);4, pRCGRP digested by EcoRⅠ and BamHⅠ,producing two fragments of about 900bp and 5 822 bp; 5, pLXSN digested by EcoRⅠ and BamHⅠ.

1重组质粒的酶切鉴定

Figure 1Electroph