摘要目的:研究干扰素-γ与一氧化氮合酶、一氧化氮及血管平滑肌细胞增殖之间的关系。方法:将不同质量浓度的干扰素-γ(250～1000U^.ml^－1)作用于培养的血管平滑肌细胞中, 采用［³H］-TdR掺入、细胞生长曲线和定量RT-PCR等方法检测血管平滑肌细胞一氧化氮合酶基因表达, 一氧化氮产生及血管平滑肌细胞增殖。结果:干扰素-γ可以诱导血管平滑肌细胞表达一氧化氮合酶基因及酶蛋白,产生一氧化氮并呈质量浓度依赖。同时还发现干扰素-γ抑制血管平滑肌细胞的DNA合成及细胞增殖与一氧化氮的产生是相平行的。结论:干扰素-γ能通过诱导血管平滑肌细胞表达一氧化氮合酶基因产生一氧化氮来抑制血管平滑肌细胞增殖。

中国图书资料分类法分类号R322.12

Study on the relation of interferon-γ

and nitric oxide with vascular smooth muscle cell proliferation

WEI Yu^＃， XU Cheng-Bin， WANG Shen-Wu

(＃Department Cardiology, People's Hospital， Beijing Medical University, Beijing100044)

MeSHInterferon type Ⅱ/pharmacolMuscle, smooth, vascular/growthNitric oxide synthase^☆Nitric oxide

ABSTRACTObjective: To study the relation of IFN-γ with nitric oxide synthase (NOS), nitric oxide (NO) and vascular smooth muscle cells (VSMC) proliferation.Methods: Various concentrations of gamma- interferon (IFN-γ, 250～1 000U*ml^－1) were added to the medium of cultured ratVSMC． ［³H］-TdR incorporation,cell proliferation assay, quantitative RT-PCR and other techniques were used to detect expression of NOS-mRNA-protein, production of NO in VSMC and proliferation of VSMC.Results: IFN-γ could induce NOS-mRNA-protein expression and produce NO in VSMC, and these effects were dose-dependent between 500～1000U^.ml^－1. Meanwhile, IFN-γ could significantly inhibit DNA synthesis and proliferation of VSMC. The inhibition effect was positively correlated with NO production.Conclusion: IFN-γ could inhibit proliferation of VSMC by inducing expression of NOS and producing NO.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:62-64)

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的增殖及迁移是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)形成及经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA ) 后再狭窄的一个关键因素。研究表明干扰

素-γ(γ-IFN)在抑制动脉粥样斑块发生和血管损伤后VSMC增生方面起着重要作用^［1，2］,但机制未明。本研究应用γ-IFN作用于培养的VSMC,采用分子生物学等技术观察γ-IFN对VSMC中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)基因表达,一氧化氮(nitric oxide, NO)产生及VSMC增殖的影响，探讨γ-IFN抑制VSMC增殖的机制。

1材料与方法

VSMC培养：取雄性200～250g Wistar大鼠的胸主动脉,分离培养VSMC,培养条件为DMEM-15%(体积分数)胎牛血清(fetal bovine serum, FBS),5%(体积分数)CO₂,37℃。用平滑肌细胞肌动蛋白(actin)单克隆抗体进行免疫组化鉴定。

NO的检测:培养的3～8代VSMC1.5×10⁵ml^－1接种于24孔板,每孔500 μl。培养36h后,换无FBS的DMEM继续培养24h,加入不同质量浓度的γ-IFN: (250、500、750、1 000)U^.ml^－1和对照组(不加γ-IFN),分别在3、6、12、18、24h收集细胞培养液(每个时间点4孔)。培养液过一次性SEP-PAK C-18柱去除酚红后,与等量的Griess试剂(10g^.L^－1对氨基苯磺酰胺及1g^.L^－1 N-(1-萘基)-乙二胺,0.52mol^.L^－1磷酸)室温下作用10 min,在紫外分光光度仪540 nm处测光吸收值。亚硝酸钠为标准品。

VSMC中NOS-mRNA表达的检测: 培养的VSMC1.5×10⁵ml^－1接种于24孔板,每孔500μl,36h后换无FBS的DMEM,继续培养24h,加入γ-IFN1000U^.ml^－1,作用于3、6、12、18、24h后提取细胞内RNA,遵照反转录试剂盒的操作要求进行反转录(reverse transcription, RT)。根据大鼠VSMC中NOS的cDNA序列设计上、下游引物,引物序列为:5′CAATAACCTGAAGCCGAAGA3′

5′GAAAAGACCGCACCGAAGAT3′

以β-actin为内参照。毛细血管PCR反应所需变性、退火和延伸温度分别为94 ℃、55℃、72℃，反应时间分别为7、7及20 s,预变性94 ℃ 25 s,后延伸72℃ 45 s,共进行35个循环。PCR产物NOS为长545 bp的片段,β-actin为长318 bp的片段,行15 g^.L^－1琼脂糖凝胶电泳。计算机辉度扫描分析结果。

NOS酶蛋白检测:采用荧光免疫法,培养的VSMC 1.5×10⁴ml^－1接种于内放有盖玻片的培养皿中,24h后,换无FBS的DMEM,继续培养24h开始实验,分2组:一组为对照不加γ-IFN,另一组加γ-IFN1000U^.ml^－1。选用Zymed公司的兔抗鼠诱导型NO合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)抗体和DaKo公司的FITC标记的羊抗兔IgG。

细胞生长曲线:1.5×10⁴ ml^－1的VSMC接种于96孔板,每孔100μl。细胞生长至50%汇合,换无FBS的DMEM继续培养24h,换50g^.L^－1 FBS的DMEM并加入不同质量浓度的γ-IFN(250、500、750、1000U^.ml^－1),继续培养24、48、72h收集细胞(每个时间点4孔),台盼蓝染色后,细胞计数。

［³H］-胸腺嘧啶脱氧核苷(［³H］-TdR)掺入:采用液闪计数法,VSMC的接种及γ-IFN的浓度同生长曲线法。检测前6h每孔加入［³H］-TdR 1.85×10⁷ Bq*L^－1(3.7×10¹⁰Bq^.L^－1,中国原子能研究院),破碎细胞,液闪计数。

统计学处理:全部数据采用(±s)表示。组间差异用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

VSMC经不同的γ-IFN作用一定时间后,测定培养液中NO代谢产物NO^－₂的产量。结果与对照组相比250U^.ml^－1的γ-IFN对VSMC无诱导作用。VSMC在500～1000U^.ml^－1的γ-IFN作用下,与对照组相比，6h NO开始升高,且随着时间的延长逐渐增高(P＜0.05),NO产量对γ-IFN在500～1000U^.ml^－1范围内是浓度依赖的,3～24h内是时间依赖的(图1)。

图1不同质量浓度的γ-IFN诱导VSMCNO^－₂产生的

时间曲线(μmol^.L^－1,±s)

Figure 1Production of NO^－₂ form VSMC induced by various mass

concentration γ-IFN at different times (μmol^.L^－1, ±s)

采用RT-PCR方法分析VSMC在γ-IFN 1 000 U*ml^－1作用下,3hVSMC内就有NOS-mRNA的表达(图2)。经计算机辉度扫描分析iNOS/β-actin比值,对照、3、6、12、24 h的比值分别为0.001、0.159、0.506、0.332、0.279、0.095。

NOS酶蛋白的检测,VSMC在γ-IFN作用12 h,荧光显微镜下可见胞质中发出绿色荧光的iNOS蛋白酶(图3上);未经γ-IFN作用的VSMC胞质中无绿色荧光iNOS酶蛋白(图3下)。

γ-IFN对VSMC生长抑制作用：(1)细胞生长曲线,计数活细胞数,每组4孔取平均值。其变异系数为CV=5%～12%(n=4)。结果显示，γ-IFN 500～1 000U*ml^－1与对照组相比可显著抑制VSMC增殖(P＜0.05)，且呈质量浓度依赖（图4）。

Rat VSMC was treated with γ-IFN (1 000 U^.ml^－1)at different times. Total cellular RNA was isola