摘要目的：观察大鼠骨骼肌肌质网上是否存在非核DNA结合蛋白。方法：应用差速离心及蔗糖密度梯度离心法分离大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白，用³²P-标记的DNA进行Southwestern印记杂交。结果：在大鼠骨骼肌肌质网膜中存在两种DNA结合蛋白，相对分子质量分别是83 000、58 000,这2种蛋白质可与不同的线状双链DNA,环状DNA及单链DNA结合。结论：大鼠骨骼肌肌质网膜中存在两种序列非依赖性DNA结合蛋白。

中国图书资料分类法分类号Q513

Sequence-independent DNA binding proteins in rat skeletal muscle sarcoplasmic reticulum

ZHAO Wen^#， NI Ju-Hua， TANG Jian， JIA Hong-Ti， XUE Lin

（#Institute of Cardiovascular Research, Beijing Medical University, Beijing100083）

MeSHSarcoplasmic reticulum/chemBlotting, SouthernNon-nuclear DNA binding proteins^☆

ABSTRACTObjective: To observe whether there exist non-nuclear DNA binding proteins in rats skeletal muscle sarcoplasmic reticulum.Methods: Skeletal muscle sarcoplasmic reticulum proteins were extracted by means of differential centrifuges and sucrose density gradient centrifuges, and southwestern hybridizations were carried out between³²P-labelled DNA and the proteins.Results:There are two DNA binding proteins, whose molecular weights are 83 000 and 58 000,in rat skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. These DNA binding proteins can bind various size and configuration of double-strand DNA, circle DNA and single-strand DNA.Conclusion:There are two sequence-independent DNA binding proteins in rats skeletal muscle sarcoplasmic reticulum.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:5-8)

正常机体细胞内DNA 结合蛋白主要存在于核内及线粒体内，作为反式作用因子调控基因的转录与表达^［1］。Hagstrom等^［2］发现家兔骨骼肌肌质网中存在特异的DNA结合蛋白，但其作用及其生物学意义尚不清楚。本实验应用差速及蔗糖密度梯度离心，提取大鼠骨骼肌肌质网（sarcplasmic reticulum,SR）膜蛋白，用Southwestern印迹杂交，发现骨骼肌SR上存在两种DNA结合蛋白。

1材料与方法

1．1动物及试剂

实验选用SD大鼠，雄性，体重150～250g，由北京医科大学动物部提供。α-³²P-dATP由北京亚辉公司提供，硝酸纤维素膜购自北京天象人公司，其余试剂均为国产及进口分析纯试剂。

1．2大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白的提取

参照文献［3］方法，取Wistar大鼠后肢骨骼肌组织20g，冰浴中剪碎，以下所有过程均在0～4℃进行。加入7.5倍体积的缓冲液A，缓冲液A含20mmol^.L^－1焦磷酸钠、20mmol^.L^－1磷酸缓冲液、1mmol^.L^－1 MgCl₂、0.303mol^.L^－1蔗糖、0.5mmol^.L^－1 EDTA、76.8nmol^.L^－1 aprotinin、1.1 μmol^.L^－1 leupeptin和0.23 mmol^.L^－1 PMSF。应用贝克曼公司内切式电动匀浆器匀浆3次，每次30 s。离心（10 000 r^.min^－1,15min），上清液经6层纱布过滤，沉淀再复溶于5倍体积的上述缓冲液中，再次匀浆和离心（10000r^.min^－1,15min）取上清，经6层纱布过滤，合并滤过液，离心（16000 r^.min^－1,30min），沉淀用下列溶液孵育30min,即0.6 mol^.L^－1 KCl、0.303mol^.L^－1蔗糖、50mmol^.L^－1 Tris^.HCl,pH7.4,离心45000 r^.min^－1,30min,沉淀即为肌质网膜囊泡粗提物，用缓冲液B复溶，缓冲液B中含20mmol^.L^－1 Tris^.maleate、0.1 mmol^.L^－1 PMSF和0.303mol^.L^－1蔗糖,pH 7.0，应用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，并贮存于－80℃备用。

1.3DNA的制备^［4］

本工作所用质粒DNA包括pCD₂/pAdVantage/ADM,pcDNA₃/ANF,pCD₂/VEGF为本室构建，pBluescript(stratagene)。质粒经转化大肠杆菌进行扩增，应用聚乙二醇纯化，获得闭合环状DNA(close-circle DNA,ccDNA),再分别用BglⅡ,HindⅢ,BamHⅠ,EcoRⅠ酶切获得线状双链DNA(double-strand DNA,dsDNA)。应用煮沸法，热变形15～20min，使双链解链，获得单链DNA(single-strand DNA,ssDNA)。

1.4³²P标记DNA^［4］

分别取100～200 ng上述dsDNA,应用111000GBq［³²P］-dATP进行随机引物标记，其标记放射比活性大于10⁹min^－1。

1.5Southwestern印迹杂交^［2］

取50 μg纯化的SR膜蛋白进行SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。先加入含有30g^.L^－1BSA的缓冲液（10mmol^.L^－1 Tris^.Cl,150 mmol^.L^－1 NaCl,0.5 mmol^.L^－1 EDTA,pH7.4）在室温封闭过夜，再加入10⁶min^－1随机引物标记的探针，孵育12 h，然后以缓冲液洗膜，每次15 min，共3次，最后进行放射自显影，在竞争实验组，除了标记的探针外，同时还加入50～200倍非标记的ccDNA,dsDNA及ssDNA,同样杂交和洗膜。

1．6骨骼肌肌质网膜蛋白纯度鉴定

应用文献［5］分别测定肌肉匀浆及SR膜制备的Ca²⁺-ATPase（肌质网标志酶）,Na⁺-K⁺-ATPase（质膜标志酶） 及azide-ATPase（线粒体标志酶）的活性，以鉴定SR制备的纯度。

2结果

2. 1大鼠骨骼肌肌质网膜制备纯度鉴定

SR膜制备的Ca²⁺-ATPase的含量较骨骼肌组织匀浆升高6.5倍［nmol^.mg^－1.min^－1:300±38(n=6) vs 40±14(n=6),P＜0.01］;SR膜制备的Na⁺-K⁺-ATPase及azide-ATPase的含量与骨骼肌组织匀浆相比含量均较低［nmol

.mg^－1

.min^－1: 14±3(n=6) vs 18±6(n=6), P＞0.05; 56±14(n=6) vs 115±21(n=6),P＜0.05］。提示此制备的SR膜纯度较高。

2.2不同长度的³²P-dsDNA与骨骼肌肌质网膜蛋白的结合

骨骼肌SR膜蛋白电泳和Southwestern印迹杂交放射自显影后结果如图1和2所示,由图1可以看出，骨骼肌SR膜蛋白电泳后可获得20多个条带，相对分子质量在15 000～50 000之间。应用³²P标记的ds pCD₂/pAdVantage/ADM(6.7kb)，dspcDNA₃/ANF(5.9kb)及dspBluescript(2.9kb)与骨骼肌SR膜蛋白进行杂交，均可见到2条同样结合带，相对分子质量分别为83000和58000。提示在骨骼肌SR中，具有与DNA结合的蛋白，这种结合蛋白与质粒DNA大小无明显关系。

图1大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白电泳结果(b)

及蛋白质相对分子质量标准(a)

Figure 1Electrophoresis analysis of skeletal muscle sarcoplasmic

reticulum proteins in rats(b) and protein molecular weight marker(a)

a,pCD2/pAdVantage/ADM (6.7 kb); b,pcDNA₃/ANF (5.9 kb);

c,pBluescript SK(+) (2.9 kb); d,pCD2/pAdVantage/ADM binding

to rat skeletal muscle nuclear proteins, compared with a,b,c.

2不同的³²P-dsDNA与大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白的结合Figure

2Different size of³²P-dsDNA (a,b,c) binding to skeletal