摘要：目的研究胚胎肝发育相关基因-1（EDAG-1）在红系肿瘤分化中的表达及意义。方法用细胞生物学、RT-PCR及Northern杂交法。结果含4.0×10^-5 mol*L^-1氯高铁血红素(Hemin)的RPMI 1640培养K562细胞5天，可使70%～80%细胞呈现正常红系特征； EDAG-1 、c-fos表达降低。结论Hemin可诱导红白血病细胞分化； EDAG-1、 c-fos表达下调可能与其有关。

自由词：胚胎肝发育相关基因-1

中图书类号：R733.7文献标识码：A

文章编号：1000-1492(2000)05-0336-03

肿瘤的诱导分化是目前临床及基础研究的热门课题，已发现大多数肿瘤尤其是血液系统肿瘤可被诱导向正常细胞转化，但分化的机制却不明了。胚胎肝发育相关基因-1(EDAG-1)是我们在用RDA技术建立的4月龄人胎肝组织与成年肝组织的差异表达基因EST文库中发现的一株未注册序列，Northern 杂交表明其mRNA约2.2 kb,经筛选人胎肝cDNA文库获1.9 kb的片段，进而利用5′RACE技术获得该基因全长序列，序列分析表明该基因编码的是由309个氨基酸组成的蛋白质，经检索与GeneBank注册序列无同源序列，已在GeneBank注册（注册号bankit316865AF228713），命名为EDAG-1。初步揭示该基因特异高表达在人胎肝组织及部分肿瘤细胞中，在成人心、肝、脾、肺、脑、胸腺、肌肉等组织均无表达(待发表资料)。鉴于4 月龄人胎肝组织富含细胞增殖、分化相关基因，我们推测该基因可能与血细胞增殖、分化有关。因此我们检测该基因在Hemin诱导分化的人红白血病细胞中的表达，观察是否与红系分化、增殖相关及在红白血病细胞诱导分化中的意义。

1材料与方法

1.1K562细胞培养、诱导分化及联苯胺染色鉴定K562 细胞由军科院基础医学研究所三所王敦成博士惠赠。按常规将细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640中，37℃、5% CO₂条件下培养。取呈指数生长期K562细胞按1×10⁹个*L^-1细胞浓度，加含4.0×10^-5 mol*L^-1 Hemin（Sigma）的上述培养液持续培养5天。取正常K562及氯高铁血红素(Hemin)诱导培养1～5天的细胞滴片，甲醛固定，滴加1%联苯胺染液3 min，滴加7.5%双氧水1 min，蒸馏水冲洗后加瑞氏液染色，水洗，干燥，光镜（10×100）计数染色阳性细胞。其中红系细胞经联苯胺染色后，胞浆呈现黄褐色，胞核为紫蓝色（计为阳性）。

1.2³H-TdR掺入法检测K562细胞增殖能力详见参考文献〔1〕。

1.3细胞总RNA的提取取诱导培养不同时间的K562细胞，用Promege公司RNA提取试剂盒提取细胞总RNA并紫外光定量。

1.4EDAG-1 cDNA探针的制备采用随机引物标记法。DNA模板25 ng，加入10 μl标记5×buffer, 3 mol*L^-1 dGTP、dTTP 、dCTP混合液各2 μl, BSA 2 μl, DNA多聚酶5U及α-³²P-dATP 5 μl,反应体积50 μl,室温1 h后终止反应并用Sephdex G-50柱纯化探针。

1.5Northern 杂交取K562细胞总RNA 30 μg进行1%甲醛变性凝胶电泳，转印硝酸纤维素膜，膜在80℃烘干2 h，加入6×SSC，5×Denhandts, 0.5% SDS, 1.0×10^-4 mg*L^-1鲑精DNA，在68℃预杂交1 h，加入变性后探针，68℃杂交过夜；以含0.5% SDS的2×SSC室温下洗膜2次，再用含0.5% SDS的0.5%×SSC 50℃洗膜2次,室温干燥后-70℃下放射自显影。

1.6RT-PCR以Oligo(DT)为起始引物，加入K562细胞总RNA 1 μg ,72℃ 10 min后, 依次加入无RNase水，10×RT buffer, 2.5×10^-2 mol*L^-1 MgCl₂, 2.5×10^-4 mol*L^-1 dNTPs, RNasin和AMV逆转录酶，反应体系为20 μl, 42℃保温 15 min后,加去离子水至100 μl。并以此为模板进行PCR。 PCR引物如下：

c-fossense5′-GAGCTGACAGATACACTCCAAGCG-3′

antisense5′- CAGTCTGCTGCATAGAAGGAACCG-3′

G3PDHsense5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′

antisense5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′

取逆转录产物5 μl为模板，依次加入10×buffer, 2.5×10^-3 mol*L^-1 dNTPs, 上下游引物，去离子水和Taq酶，反应体积为25 μl, 循环条件为94℃ 1 min, 60℃ 1 min, 72℃ 1 min，共18或30循环，在同一条件下，每次PCR以G3PDH作内对照，PCR产物经1.5%琼脂糖中电泳，凝胶成像仪扫描成像。

2结果

2.1Hemin诱导K562细胞向红系分化及细胞增殖检测：联苯胺染色发现，经Hemin诱导培养5天，约70% K562细胞胞浆呈黄褐色，而正常培养的K562细胞仅有6%左右呈黄褐色胞浆（图1）；细胞增殖性检测发现经Hemin诱导后，K562细胞³H掺入明显降低（表1）。

图1Hemin诱导对K562细胞分化的影响

A.RPMI 1640+Hemin培养5天的K562；

B.RPMI 1640培养的K562

2．2EDAG-1在诱导分化的K562细胞中的表达用α-³²P标记EDAG-1cDNA 探针进行Northern Blotting, 结果显示，在Hemin诱导培养而向红系分化的K562细胞中，EDAG-1表达水平明显下调（图2）。

表1Hemin诱导对K562细胞增殖的影响 (n=5)

Hemin诱导 ³H掺入CPM（±s） 联苯胺染色阳性（%） 0天

6 054.3±655.5 6 1天 5 774.8±391.9 14 2天 5 710.3±513.9 17 3天 4 356.3±638.3^** 19 4天 1 943.5±146.0^** 35 5天 1 870.5±831.6^** 73

t检验，与0天比较：^**P＜0.01

图2EDAG-1在Hemin诱导分化的K562细胞中的表达

上排：18 s RNA下排:2.2 kb EDAG-1

2.3c-fos在K562细胞中的表达用正常及经Hemin诱导培养的K562细胞总RNA（各1 μg）反转录产物进行PCR, 结果显示，c-fos在K562细胞组，18或30循环PCR均出现明显阳性扩增，而在Hemin诱导分化K562细胞组，30循环PCR仅出现弱阳性扩增，18循环PCR无明显阳性扩增（图3）。

图3c-fos在不同处理K562细胞中的表达

A.18循环；B.30循环；C.G3PDH 内对照；D.DL2000 Marker; E.Hemin诱导5天的K562细胞组；F.正常K562细胞组

3讨论

K562细胞是人红白血病肿瘤细胞，具备恶性肿瘤细胞生物学特征。它也可被不同试剂诱导向正常细胞分化，如维甲酸及DMSO可诱导其向粒系分化； Hemin等可诱导其向红系分化^〔2〕。在向红系分化过程中，细胞逐渐表现幼红细胞的某些特征如胞浆中出现血红蛋白等，同时细胞增殖能力下降。本研究用含4.0×10^-5 mol*L^-1 Hemin的RPMI 1640培养诱导K562细胞，使其向红系分化。实验发现随Hemin 诱导时间增加，³H掺入明显降低，说明K562细胞的增殖能力下降。同时联苯胺染色发现有约70%的胞浆呈黄褐色的细胞，表明有大部分K562细胞已分化成红系细胞，具有产生血红蛋白的能力。

我们已发现EDAG-1在胚胎及部分肿瘤组织中高丰度表达(待发表资料)。本实验Northern杂交也证实其在K562细胞中高表达，而在经Hemin诱导4～5天 K562细胞中表达明显下调，提示该基因可能与细胞增殖或分化尤其是红系的分化相关，但机制不清。RT-PCR发现c-fos在Hemin诱导5天的K562细胞中表达也明显下调,这类下调在其它肿瘤诱导分化过程中常常见到，被认为是肿瘤诱导分化的机制之一^〔3〕。本实验结果中EDAG-1与c-fos表达降低的意义及相互关系有待进一步研究。

Expression of EDAG-1 genes in K562 cells induced by hemin

Wang Dan, Wang Siying, Hu Zhaoping et al

(Dept of Hematology, Anhui Provincial Hosptial,Hefei230001)

Abstract：ObjectiveTo study the expression and role of EDAG-1 in erythroleukemia differentiation induced by Hemin. MethodsTechniques of<