摘要目的研究脐血造血干/祖细胞和淋巴细胞的免疫学特点以及脐血干/祖细胞含量和细胞抗原特征对骨髓重建造血的影响。方法收集34份脐血，用流式细胞仪双标法同时检测细胞表面的两种不同抗原。结果34份脐血平均有核细胞数每份为(12.3±4.3)×10⁸个，CD34⁺的绝对细胞数每份为(1.98±1.30)×10⁷，其中CD34⁺ CD38⁺细胞占CD34⁺细胞的84.6%±9.1%；脐血淋巴样细胞群体中CD3⁺表达率为60.50%±11.80%，CD4⁺为38.66%±11.80%；CD8⁺为21.70%±6.37%，CD4⁺/CD8⁺比值是1.93±0.91；CD8⁺ CD45RA⁺细胞占CD8⁺细胞群体的98.93%±0.36%；CD4⁺ CD45RA⁺胞细胞占CD4⁺细胞的90.96%±6.96%。结论脐血中干/祖细胞数量可以满足正常体重的成人脐血移植对干/祖细胞的需要。脐血中T淋巴细胞多为功能未成熟细胞，具有较小的抗原反应性，这有利于降低移植中移植物抗宿主反应。

中图分类号R446.63；R329.2；R714.51

文献标识码A文章编号1000-1492(2000)04-0294-03

脐血富含优质的造血干/祖细胞，且来源广泛，易于取材，是继骨髓后用于同种异基因干/祖细胞移植的一种新的来源，日益受到人们的关注。据报道，国内外已经成功用脐血移植治疗了近千例各种良、恶性肿瘤患者，但多数应用于儿童。目前，正在探讨单份脐血应用于成人的可能，本文通过测定脐血干/祖细胞以及其免疫细胞的表型，来分析脐血的免疫学特征。

1材料和方法

1.1脐血及其有核细胞采集取自健康、正常足月分娩的胎儿脐血。采用密封式采血法。胎儿分娩出立即断脐，碘酒消毒脐静脉穿刺处，行穿刺，使脐血在重力的作用下流入装有28 ml ACD保存液的200 ml容积的无菌采血袋。采集过程中不停地摇晃血袋，充分混匀。采集后，脐血和无菌的6%羟乙基淀粉氯化钠溶液(Fupont Pharma提供)按4∶1的比例完全混匀，在超净无菌台内静置45 min后，弃去下层红细胞，取上层少许细胞悬液，供实验使用。对照组取自健康献血员静脉血，用4.5×10⁴U*L^-1的肝素以1∶9抗凝。

1.2抗体标记用双色免疫荧光标记法检测细胞膜抗原，取对照管和测定管若干支，每管中加入70 μl脐血，在测定管中分别加入以下组合的抗体各20 μl：CD34-FITC/CD38-PE、CD34-FITC/CD45RA-PE、CD4-FTIC/CD8-PE、CD8-FITC/CD45RA-PE、CD3-PE，以上抗体均为IgG1亚型，故其同型对照管为IgG1-FITC/IgG1-PE；另为CDw90-FITC/CD34-PE测定管中，CD34-PE抗体为IgG1+IgG2a+IgG2b亚型，CDw90-FITC抗体为IgG1亚型，其同型对照管为IgG1-FITC/IgG1+IgG2a+IgG2b-PE。混匀后，室温避光反应20～30 min。反应后每管加0.5 ml红细胞裂解，室温反应10 min后，再加入0.5 ml的pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)，静置5 min，离心10 min，沉淀再用PBS洗2次后，并用1 ml PBS悬浮起细胞。以上所有试剂均购自法国Immuntech公司。

1.3细胞检测运用流式细胞仪检测，选定所需检测的细胞群体，以荧光强度1界限，大于1者为阳性。首先用同型对照管，将FITC-PE双参数直方图中两者的阳性率都调至2%±0.5%范围内，然后在同样条件下检测相应的测定管。其中CD34-FITC/CD38-PE、CD34-FITC/CD45RA、CD34-PE/CDw90-FITC结果为占全部有核细胞的比例，每管至少检测50 000个细胞。其它各测定管以淋巴样细胞为对象，每管至少检测5 000个细胞。流式细胞仪为美国Coulter公司Epics-XL型。

1.4数据分析用System Ⅱ分析软件结果为±s形式。如图1，根据细胞的物理学特点，在直方图1中的淋巴样细胞所在的位置A门，直方图2中B门为A门中细胞两种标记物的表达情况，其中B₂为两种抗体同时表达的区域。

表2淋巴细胞样群体中各表型群体的含量

n CD3⁺ CD4⁺ CD8⁺ CD4/CD8^△ CD4⁺CD45RA⁺ CD8⁺CD45RA⁺ 脐带血(%) 34 60.50±11.8 38.6±11.8 21.70±6.37 1.93±0.91 90.96±6.96 98.93±0.36 外周血(%) 20 67.20±3.00^* 34.72±2.78 27.12±2.94^** 1.29±0.13^** 55.67±11.20^** 89.27±5.00^**

注：^*P＜0.05，^**P＜0.01；^△此为比值，不是百分比

图1双表达细胞数据分析意图

2结果

2.1脐血体积本实验所收集的34份脐血，不计抗凝剂的体积，平均脐血的体积每份为99 ml±22 ml，最大的体积为150 ml，最小的体积为60 ml；平均每份脐血中有核细胞数为(12.3±5.9)×10¹¹*L^-1，最高25.9×10¹¹*L^-1，最低是6.4×10¹¹*L^-1。

2.2脐血中有核细胞中免疫标记物的结果CD34⁺细胞及其各亚型在全部有核细胞中的比例见表1。平均每份脐血中CD34⁺细胞的绝对数为(1.98±1.30)×10⁷，CD34⁺CD48^-细胞数为(0.27±0.26)×10⁷。

2.3脐血淋巴样细胞群体中各表型的百分比见表2，平均每份脐血中CD3⁺细胞绝对数为(96.2±18.8)×10⁷。

表1脐血中干/祖细胞及其亚型的结果

抗体 均值

(%) 最大值

(%) 最小值

(%) CD34⁺ 1.61±0.91 4.6 0.7 CD34⁺CD38^+* 84.6±9.1 94.6 61.4 CD34⁺CD45RA^+* 63.0±7.5 77.8 49.8 CD34⁺CDw90^+* 3.48±2.26 8.4 0.4

注：^*所提供百分比均为CD34⁺细胞的含量

3讨论

脐血干/祖细胞移植已经开始应用于造血和非造血系统有关肿瘤的治疗，它是此类疾病根治的理想方法之一。 在所检测的34份脐血中，CD34⁺的平均数每份为(1.98±1.30)×10⁷。目前多数学者^〔1〕认为用于移植的CD34⁺不应低于2×10⁵个*kg^-1体重，中性粒细胞不应低于1×10⁷*kg^-1受者体重。依此计算，所采集单份脐血中CD34⁺细胞的量能够满足普通体重成人所需。CD34⁺亚型中CD34⁺ CD38^-浓度为13%±8.6%，平均绝对数每份为(0.27±0.26)×10⁷。CD38是反映细胞活性和成熟程度的抗原，成熟细胞高表达CD38。据报道，在体外培养实验中，CD34⁺CD38^-群体细胞长期培养增殖能力高于CD34⁺CD38⁺的细胞群体^〔2〕；同时此亚型细胞平均端粒长度长于外周血中相应细胞端粒的长度^〔3〕。因此脐血中CD34⁺CD38^-细胞作为分化较早阶段的造血干祖细胞，它的含量高低对受体骨髓的重建较有意义，比单纯用CD34⁺含量对脐血移植预后的判断更有价值。

本实验测了34份脐血和20份成人外周血淋巴细胞的表型，脐血中T淋巴细胞比例明显低于成人(CD3⁺分别为60.5%±11.8%和67.2%±3.0%，P＜0.05)，CD8⁺T细胞低于外周血，且CD4⁺CD38RA⁺和CD8⁺CD45RA⁺比例均显著高于外周血(P＜0.01)，D’Arena等^〔4〕也有相似报道；但脐血的CD4/CD8比值显著高于成人外周血(分别为1.93±0.91和1.29±0.13，P＜0.01)，这与D’Arena等报道不同。CD45RA为“裸”细胞标记物，它反映细胞未经抗原刺激，脐血中T淋巴细胞(如CD4和CD8)绝大多数同时表达CD45RA，即它们多为初始型细胞。供体CD8⁺细胞是移植后发生移植物抗宿主反应(GVHD)的主要效应细胞^〔5〕，脐血中CD8⁺细胞不仅含量低，而且在功能上主要是“裸”细胞，其细胞毒性低；Chipeta等^〔6〕研究表明：脐血中T淋巴细胞对抗原刺激和PHA刺激的应答反应较正常人外周血淋巴细胞低；因此移植后GVHD发生率低于骨髓和外周血，甚至HLA有部分位点不合的供者和受者间亦可进行脐血干/祖细胞的移植。

基金项目：安徽省“九五”攻关项目(基金编号：961007)