摘要目的研究食管支架术后不同时间局部食管组织中炎性细胞浸润及分布的变化，以及与再狭窄形成的关系。方法采用免疫组化(ABC法)检测支架术后1、2、4、8周组织中CD3、CD19、CD68的表达状况，从而反映出巨噬细胞(MΦ)、T-淋巴细胞(T-LC)、B-淋巴细胞(B-LC)的浸润及分布状况。制备再狭窄组织的细胞悬液，采用流式细胞分析法检测组织中3种细胞的含量变化。采用特殊染色法分析组织中肥大细胞(MC)的分布状况。结果支架术后1、2周组织中有明显的T-淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞浸润，其细胞含量较正常食管显著升高，而B-淋巴细胞含量极少，术后4、8周各种细胞的含量及分布与正常食管相似。结论巨噬细胞、肥大细胞及T-淋巴细胞与支架术后再狭窄的形成存在密切关系，可能是局部纤维化的重要调控细胞。

中图分类号R571.1；R619；R655.4

文献标识码A文章编号1000-1492(2000)04-0256-04

Changes of related inflammatory cells in esophageal tissue after stenting

Wan Xinjian,Li Zhaoshen,Xu Guoming et al

(Dept of Gastroenterology,Changhai Hospital,

The Second Military Medical University,Shanghai200433)

AbstractObjectiveTo study the infiltration and distribution of inflammatory cells,and the relation with re-stenosis,at several times after stenting. MethodsThe number and distribution of macrophage,T-lymphocyte,B-lymphocyte in esophageal tissue at week 1,2,4,8 after stenting had been measured by flowcytometry and immunohistochemical methods(ABC). Special staining was used to analyse the distribution of mast cells. ResultsThe T-cell,MΦ，mast cell infiltrated greatly in esophageal tissue 1,2 weeks after stenting,and the number of these cells was much more than that in normal esophagus. But B-cell was very little,the number and distribution was similar to normal esophagus at 4,8 weeks after stenting. ConclusionMΦ，mast cell and T-cell are closely related with restenosis after esophageal stenting,and may be the key regulatory cells in local fibrosis.

MeSHesphagus stenosis; stent

巨噬细胞(MΦ)、T-淋巴细胞(T-cell)、肥大细胞(MC)作为免疫系统的主要成员，在组织创伤愈合及器官纤维化过程中发挥重要的作用，是主要的调控因素。目前的研究发现，在组织损伤愈合过程中，局部有大量的MΦ、T-cell、MC浸润，并表达出相关的致纤维化细胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、TGFβ₁、PDGF等。正是由于这些细胞因子的作用，促使了局部肉芽组织的形成及纤维结缔组织产生，进而表现为瘢痕形成及纤维化。在不同类型的创伤中，起调控作用的炎性细胞存在一定的差异。再狭窄是食管支架术后最常见的远期并发症，主要表现为支架放置部位大量肉芽组织形成及纤维化，最终导致食管腔再次狭窄。作为组织创伤愈合的一种形式，其病理过程的调控机制与一般的创伤可能存在一定的相似性，有关这方面的研究国内外尚未见有文献报道。本实验采用免疫组织化学的基本方法探讨再狭窄过程中相关炎性细胞的调控机制。

1材料与方法

1.1试剂及仪器0.05%胶原酶，0.1%胰蛋白酶(华美公司)，70%乙醇，ABC免疫组化试剂盒(Vector公司)，CD3、CD68单克隆抗体(华美公司)，CD19单克隆抗体(武汉博士德公司)，0.01 mol·L^-1 PBS(pH 7.4)，DAB溶解液(pH 5.0)(上海华顺公司)，抗体稀释液(10%小牛血清-PBS液)，封闭剂(10%绵羊血清-PBS液)，0.3% H₂O₂-甲醇液，3% H₂O₂，FITC标记的二抗IgG(上海华美公司)，0.5%硫堇溶液(上海生化试剂公司)，0.2%醋酸溶液(上海生化试剂公司)，流式细胞分析仪(Becton Dickinson公司)，150目、250目铜网，倒置显微镜(Olympus公司)。

1.2动物实验标本采集、处理选择16只实验犬，经“自体阔筋膜移植固定法”置入并固定食管支架。具体操作如下：无菌手术下切开颈部皮肤，游离出颈部食管，内镜引导下置入食管支架，使其上端定位于颈部游离段食管。将阔筋膜附着于置架部位的食管外壁，用医用不锈钢细丝两处缝合固定。术中局部注射少量青霉素，术后予半流质饮食。所有术后实验犬均分为4组，分别观察1、2、4、8周。届时分批处死动物，取出置架部位的食管组织分别制成石蜡、冷冻切片及细胞悬液。另取4例正常犬食管组织为对照。

1.3细胞悬液制备及流式细胞分析CD3、CD19、CD68表达将留取的新鲜组织用眼科剪剪为1.0 mm大小的小块，并用冰冷生理盐水漂洗4次。0.05%胶原酶37℃消化20 min(1.0 g组织加入消化液10 ml)，同时间断地振荡。将250目铜网扎在小烧杯上，把消化后组织细胞悬液倒于网上，以试管底端轻搓组织块，直到组织搓完。离心沉淀500转*min^-1，2 min，用PBS液将细胞浓度调至10⁹个*L^-1，取20 μl分别与10 μl CD3、CD19、CD68单抗原液混匀，室温下孵育30 min。PBS洗3次后与FIT-C标记的二抗IgG(1∶40)混匀，4℃静置30 min。PBS洗2次后，调细胞浓度为10⁹个*L^-1上机，每次计数2万个细胞，根据光强度确定CD3、CD19、CD68表达量。对照组不加一抗，其余步骤相同。流式细胞结果采用方差分析进行统计。

表1流式细胞法检测支架术后组织中CD3、CD19、CD68的表达(±s,n=4)

1周(%) 2周(%) 4周(%) 8周(%) 正常(%) CD3

19.45±1.40^**

28.17±2.76^** 9.05±1.82 7.27±1.32 8.24±0.24 CD19 6.11±0.17 5.96±0.14 8.76±1.84 5.32±1.96 6.99±1.09 CD68 18.16±0.51^** 23.47±2.09^** 9.27±2.05 6.76±2.47 8.57±2.16

与对照组比较：^**P＜0.01

表2免疫组化检测食管支架术后组织CD3、CD19、CD68表达

组别 n CD3 CD68 CD19 - + - + - + 术后1周 4 0 1 3 0 0 2 2 0 3 1 0 0 术后2周 4 0 0 2 2 0 1 3 0 4 0 0 0 术后4周 4 2 2 0 0 3 1 0 0 4 0 0 0 术后8周 4 3 1 0 0 3 1 0 0 4 0 0 0 正常 4 3 1 0 0 4 0 0 0 4 0 0 0

+：阳性细胞数＜10%，：10%～50%，：＞50%，-：无表达

1.4免疫组化ABC法检测CD3、CD19、CD68表达切片脱蜡至水→0.01 mol·L^-1PBS洗5 min→0.3% H₂O₂室温孵育10 min→PBS洗3×5 min→封闭剂37℃ 20 min后甩去，勿洗→一抗37℃ 60 min→PBS洗3×5 min→生物素化二抗37℃ 30 min→PBS洗3×5 min→加ABC混合液，37℃ 30 min→PBS洗3×5 min→DAB显色→苏木精衬染封片→显微镜观察。注：CD19须用冰冻切片。

1.5硫堇法肥大细胞染色切片脱蜡至水→硫堇溶液染色45 min→ddH₂O稍洗→醋酸溶液分化5 min→自来水洗2 min→用吸水纸将切片吸干→二甲苯透明，中性树胶封固。

1.6免疫组化及特殊染色结果分