中图分类号R394.2；R342.3；R446.8

文献标识码A文章编号1000-1492(2000)04-0247-04

历经科学家10年艰辛，人类基因组计划（Human genome project, HGP）终于完成了基因组基本框架图。至此，蕴含在人体细胞内23对染色体上的30亿个碱基对序列已被全部揭示，从而完成了生命本质意义上的第二张“人体解剖图谱”。伴随HGP实施和测序工作的完成,一种全新的基因诊断技术-基因芯片应运而生。二者相得益彰，极大地推进了生命科学的发展。本文就基因诊断和基因芯片及其对检验医学的影响作一总结。

1基因诊断

传统的疾病诊断方法都是以疾病或病原体的表型(phenotype)为依据。这种“表型诊断”有许多不足之处：①表型的改变在很多病理情况下不具特异性；②疾病的表型改变往往出现较晚，待组织、体液、分泌排泄物、病原微生物出现可检测的表型物质时，常已非疾病的早期，因此易延误诊断；③很多疾病本身并不呈现显著的表型改变，采用传统的检测方法常呈“假阴性”反应；④表型诊断常常是被动的，只能“可查而不可防”。基因的载体是DNA作为生命的物质基础，DNA结构与功能的改变会导致生物体表型的变化。直接探查基因的存在状态及功能，即基因型（genotype）的改变,可对疾病作出可靠诊断。这种在DNA水平上对疾病进行的诊断称为基因诊断(genetic diagnosis)，又称DNA 诊断。疾病相关基因的探查、检测和基因工程诊断试剂研究的科学称为诊断分子生物学(diagnostic molecular biology)。基因诊断属于全新内容、全新技术和全新概念的实验室诊断方法。

1978年，美国科学家首次采用羊水细胞对胎儿进行血红蛋白病的产前基因诊断获得了成功，从此开创了疾病基因诊断的新纪元。此后，随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是HGP的实施和人类基因组测序的完成，基因诊断更是前景诱人，基因诊断相关产业有着巨大的社会效益和经济效益。基因诊断之所以发展迅速，主要是它具备了高亲和性、高度精确性、高度敏感性和高度集成性的优点。它能以“是”或“不是”的简洁结论来回答临床医学中遇见或预见的问题。基因诊断不仅可对某些疾病作出准确检测,还能对疾病的易感性、发病类型和阶段、预后、感染性疾病以及疾病抗药性作出判断。

基因诊断所用的检测技术为近年发展起来的核酸检测方法。常用方法有：PCR及其相关技术、DNA原位杂交(DNA in situ hybridization)、DNA测序、差异显示（differential display）。基因诊断技术，用于研究基因差异表达， 对那些具有组织和分化阶段特异性表达的基因进行检测，以研究某基因是否处于活化状态；还可用于病原生物的检测，不仅可检出急性感染，也可检出潜伏感染；既能诊断既往感染，也能诊断现症感染。尤其对那些不易体外培养（如艾滋病病毒、各种肝炎病毒等）和不能在实验室安全培养的病原体，采用基因诊断具有突出的优点。采用DNA长度片段多态性分析（RFLP）还可对病原体（病毒、细菌、寄生虫）进行基因分型。

2基因芯片技术及应用研究

HGP已基本完成基因组测序工作。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能，因为只有知道其功能才能破译人类基因。功能基因组学（functional genomics)、蛋白质组学(proteomics)的提出就是为实现破译进而改造基因这一目标。基因组计划的研究成果必须在疾病诊断、基因治疗、药物筛选等领域发挥重要的作用，基因芯片技术就是为实现这一目标而建立。

基因芯片(gene chips) 又称DNA 芯片(DNA chips)或DNA微阵列（DNA microarray)。它是采用光刻合成或高速打印技术在硅片、玻璃或尼龙膜上制造的DNA微阵列。样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，同DNA微阵列杂交后通过荧光扫描仪扫描和计算机分析，从而获得样品中大量基因序列及表达的信息。该技术具有高通量、集成化和自动化的特点。它是继单克隆抗体技术和PCR技术之后生命科学中的又一重大技术创新，甚至是大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命^〔1〕。

基因芯片技术是高效、大规模地（同时检测上万个基因）获取相关生物信息的高科技产物。目前，该技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析（如单碱基多态性SNPs）、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。最近正在试用于环境化学毒物的毒性筛选、细菌（如结核杆菌）耐药菌株鉴定和药敏检测、探查病原生物致病基因和抗生素基因等。从80年代初DNA的杂交测序（sequencing by hybridization，SBH) 概念的提出，到90年代初以美国为主开始进行的各种生物芯片的研制，芯片技术得以迅速发展。许多公司及政府机构均对此表现出极大兴趣，并投以可观的财力。

2.1基因芯片的基本原理^〔2，3〕基因芯片的基本原理同SBH。即任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列：

(1)CTCATATG

(2) GCTCATAT

(3)AGCTCATA

(4) TAGCTCAT

(5)TTAGCTCA

这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。

基因芯片的关键在于高密度、集成化的微阵列制作。基本方法有三类：一是光刻法（photolithography)，二是机械点样法(mechanical microspotting)，三是喷墨打印法（ink jetting）。

寡聚核苷酸原位光刻合成技术是由美国Affymetrix公司开发的。先在载玻片上铺上一层连接物（linker），其5'-羟基末端连上一个紫外光敏保护基，可用光照去除，用特制的光刻蔽光膜（photolithographic mask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光照作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学法加上第一个核苷酸。所加上的核苷酸种类和在芯片上的位置事先确定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点上加上另外3种核苷酸完成第一位核苷酸的合成。因此，n个核苷酸长的芯片需要4n个步骤。例如：一个上述12核苷酸长的芯片通过4×12个化学步骤，8 h可能合成65 536个探针，探针阵列密度可达4×10⁶/cm²。 这种原位光刻合成每步的反应所需的蔽光膜代价昂贵。最近，Wisconsin 大学开发了无蔽光膜光刻合成技术（maskless lithography）。该技术使用了数码光处理器（digital light processor）,用48万个铝镜片聚焦在芯片上，从而使基因芯片的制作成本大大降低，为芯片走向实验室应用铺平了道路。 机械点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样装置直接点在芯片上。采用的自动化装置有一套计算机控制三维移动装置。点样针从多孔板取出样品直接点在芯片上^〔4〕。

喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。支持物经过包被后，计算机根据芯片上不同位点探针的序列需要,将特定的碱基喷印在芯片的预定位置上。

其它还有电子芯片、三维芯片等。电子芯片是由美国Nanogen公司创立的，目前国内清华大学和复旦大学也在开发这一技术。三维芯片是由美国的Packard、Motorola、Argonne国家实验室与俄罗斯Engelhardt分子生物学研究所合作开发的一种芯片技术。凝胶条的三维化能加进更多的已知物质，增加了敏感性。此外，可以在芯片上同时进行扩增与检测。以三维构象形式存在的生物大分子以其天然状态存在凝胶条上，可以进行免疫测定，受体-配体研究和蛋白组分析。

2.2DNA杂交和检测待检基因与探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。在标记上，目前采用的传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。 PCR过程中的DNA标记一是末端标记：在DNA扩增时，在引物上标记有荧光探针，使新形成的DNA链末端带有荧光探针；二是随机插入：选择四种碱基，使其中一种或几种挂有荧光探针，在PCR扩增过程中，带有荧光探针的碱基和不带荧光探针的碱基，同时参与DNA链的形成。用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上靶基因的荧光信号，通过计算机处理即可获得靶基因的结构或表达信息。目前的扫描仪，根据原理不同可分为两类：一是激光共聚焦荧光检测（laser con-focal fluorescence detection）; 另一种是电荷偶连照相机(charged-coupled device camera，CCD)摄像。前者的特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用；后者的特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用。

2.3基因芯片的应用

2.3.1基因差异表达检测^〔5〕生命活动中基