摘要目的探讨硝酸纤维素膜为固相载体的酶免疫测定法检测甲胎蛋白(AFP)。方法以硝酸纤维素膜代替常规ELISA中的固相载体聚苯乙烯板，其余步骤按ELISA方法操作。结果以AFP标准品作试验，进行方法学探索，测出最佳包被抗体浓度为100 mg^．L^-1,酶标抗体稀释度为1∶4 000。不同来源不同孔径的硝酸纤维素膜无差异；同时发现包被过程中的封闭处理能减少非特异性反应；保存试验证明包被抗体的硝酸纤维素膜至少可保存2周。结论该法具有特异性强、重复性好、灵敏度高的特点，通过与常规ELISA检测血清标本AFP含量值的比较，表明该法可半定量测定AFP的含量，尤其适用于标本的初步筛选。

自由词硝酸纤维素膜

中图分类号R446.61；R73-3

文献标识码A文章编号1000-1492(2000)04-0253-03

Application of detecting AFP of dot-ELISA

Huang Baojun, Wang Hongjun, Li Ruizhu

(Department of Immunology, Anhui Medical University, Hefei230032)

AbstractObjectiveThe enzyme immunoassay in which the solid state carrier is served as the nitrocellulose membrane was used to detect α-fetoprotein (AFP). MethodsThe solid state carrier with nitrocellulose membrane substituting for polystyrene plate among the convention ELISA, the other step was operated according to ELISAs method. ResultsThe optimum bundle by antibody consistency was 100 mg·L^-1, and enzyme linked antibody of dilution 1∶4 000. The experiment indicates that the nitrocellulose membrane of different apertures and different sources did not have clear difference. The quench could reduce the nonspecific reaction by wrapping. Preserving experiment proved that the nitrocellulose membrane wrapped by antibody could be stored at least two weeks.ConclusionExperiment proves that this method possesses good specialties, repetitions and high sensitivity. Compared with convention ELISAs checkout serum specimen AFPs content value, it is suggested that this method can measure the content of AFP quantitively, particularly suitable for the specimen screen.

MeSHcellulose; alpha-fetoproteins/analysis; enzyme-linked immunosorbent assay

Free wordnitrocellulose membrane

斑点-ELISA近年来已广泛用于临床上各种标本的测定^〔1～3〕。其原理是利用吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体，使抗原抗体反应在膜上进行，结合在硝酸纤维素膜上的酶抗体结合物通过将底物分解成不溶性的产物而沉积，在硝酸纤维素膜上形成斑点。待测抗原或抗体含量的高低可通过膜上斑点颜色的深浅来判断。由于斑点-ELISA具有特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器、操作简便等优点，近年来在基础医学研究和临床检验等领域得到迅速发展和广泛的应用。本文试用斑点-ELISA检测血清标本甲胎蛋白(AFP)的含量，并对实验有关问题进行探讨，现报道如下。

1材料和方法

1.1材料AFP标准品，批号940922，含量为400 μg·L^-1，上海生物制品研究所；马抗人AFP抗体，批号940701，蛋白含量为36 g·L^-1，上海生物制品研究所；辣根过氧化物酶，批号940411，上海丽珠东风生物技术有限公司；硝酸纤维素膜：浙江四青生化材料厂(孔径分别为0.22、0.3、0.45 μm)，北京化工学校(孔径分别为0.22、0.3 μm)，Sigma公司(孔径为0.3 μm)；显色剂：二氨基联苯胺四盐酸(批号931014，北京化工厂)30 mg溶于40 ml pH 7.5 Tris-HCl缓冲液，避光搅拌3 h过滤，临用前加入H₂O₂，终浓度为0.1%。

1.2酶标马抗人AFP抗体的制备采用改良过碘酸钠法，作HRP标记马抗人AFP抗体，小量分装，-30℃冻存。

1.3双抗体夹心斑点-ELISA法按照沈大康等^〔4〕报道的方法并做改良。将硝酸纤维素膜切割成条状，画上格子，用pH 7.4的PBS浸泡10 min，室温干燥后在每格中央点加100 mg·L^-1的抗AFP抗体2 μl，室温放置1 h使抗体蛋白与膜条充分结合，然后放置于10%小牛血清中孵育2 h以封闭膜条上剩余的蛋白质结合位点，PBS洗涤后于4℃或-20℃保存。检测标本时，在膜上每格中央滴加不同浓度的AFP标准品或待检血清标本2 μl，孵育1 h后，用含0.05%吐温的PBS振荡洗涤5 min×3次，然后将膜条置于1∶4 000稀释的酶标抗体中孵育30 min，同上洗涤后将膜条置于新鲜配制的显色剂中，室温避光5 min流水冲洗终止反应。1.4结果观察结果目测，阴性反应膜条不显色，如在膜上出现棕色的染色斑点，即为阳性反应，并且斑点颜色的深浅随血清标本中AFP含量的高低而变化。

1.5常规ELISA检测血清标本AFP的含量试剂盒购自上海生物制品研究所，按说明书操作。

2结果

2.1检测系统条件的确定

2.1.1包被抗体浓度的选择分别用200、100、50、25 mg·L^-1的抗AFP抗体包被硝酸纤维素膜，与含量分别为400、200、100、50、25 μg·L^-1的AFP标准品做方阵滴定，同时设立阴性对照及空白对照。当包被抗体浓度为100 mg·L^-1，随着样本AFP含量的减少，膜条显色依次递减，结果最佳，故选用100 mg·L^-1的抗AFP抗体为包被浓度(表1)。

表1包被抗体浓度的选择

包被抗体的浓度

(mg·L^-1) 甲胎蛋白含量(μg·L^-1) 400 200 100 50 25 阴性对照 200 # # - - 100 # - - 50 - - 25 + - -

注：“#、、”代表膜条斑点显色的深浅；“-”代表膜条不显色2.1.2酶标抗体最适稀释度的选择将酶标抗AFP抗体从1∶1 000起倍比稀释至1∶8 000，分别与AFP标准品及阴性对照进行测定，发现当酶标抗AFP抗体稀释度为1∶4 000时，阳性的膜条呈明显的棕色而阴性对照不显色，故选1∶4 000为酶标抗体的稀释度。

2.1.3不同封闭条件的影响用10%小牛血清、10%兔血清、1% BSA分别对膜条进行封闭并比较，结果表明均能满意地封闭膜条上的剩余的蛋白质结合位点。因此，实际工作中我们选用10%小牛血清作为封闭剂。

2.1.4不同膜的比较经过对浙江四青公司、北京化工学校和Sigma公司生产的不同孔径的硝酸纤维素膜的比较，各种膜之间在敏感性、特异性及背景颜色方面无显著差异，但北京产品较薄，试验过程中易于划痕，浙江产0.3 μm的硝酸纤维素膜质地较厚，点样不易扩散，吸附蛋白质性能好。

2.2方法学考察

2.2.1灵敏度与重复性在确定的最佳试验条件下，用AFP标准品重复试验，可见随着AFP含量的增加，硝酸纤维素膜显色也逐渐加深，在AFP含量为50 μg·L^-1时，膜条显色为浅棕色，与阴性对照对比明显。结果如表2所示，表明该法的检测灵敏度可达50 μg·L^-1。

表2甲胎蛋白含量与硝酸纤维素膜显色的关系