摘要目的观察mIL-12基因转染的小鼠树突状细胞(DC)功能的改变。方法分离小鼠骨髓单个核细胞与rmGM-CSF和rmIL-4培养1周，对培养的细胞进行形态学观察，FACS检测细胞表面DEC205、CD86表达。以mIL-12重组腺病毒转染培养的DC， ELISA测定培养上清中mIL-12的水平,混合淋巴细胞反应检测转染细胞的功能。结果培养1周后，得到具有典型DC形态的细胞，以mIL-12重组腺病毒为载体转染DC, 培养上清中可以检测到较高水平的mIL-12；与对照组相比转染细胞能明显地刺激混合林巴细胞反应。结论小鼠骨髓单个核细胞经GM-CSF和IL-4培养1周，生成大量DC, mIL-12重组腺病毒感染培养的DC对T细胞刺激显著增强。

中图分类号R329.24

文献标识码A文章编号1000-1492(2000)02-0094-04

mIL-12 gene transferred murine dendritic cells stimulate mixed lymphocyte reaction

Xu Tong, Yang Jingqing, Yin Huijun et al

(Dept of Pediatrics, Peoples Hospital, Beijing Medical University，Beijing100044)

AbstractObjectiveTo observe the function of dendritic cells(DC) transfected with mIL-12 (murine IL-12) gene. MethodsMonocytes isolated from murine bone marrow were cultured with rmGM-CSF and rm-IL4 for 7 days. Characteristics of the cultured cells were observed and the expression of DEC205 and CD86 was detected by FACS. DC derived from culture were transfected with recombinant adenovirus containing mIL-12 gene. mIL-12 in the supernatant was detected by ELISA. MLR was studied with different types of DC. ResultsAfter 7 days of culture, a large number of cells with typical characteristics of DC were observed. The mIL-12 level in the supernatant of transfected DC was high. More noticeable MLR was found with DC transfected mIL-12 gene in comparison with the control. ConclusionGeneratin of large number of DC from murine bone marrow monocyte cultures supplemented with GM-CSF and IL-4 for 1 week. The function of DC transfected with AdCMIVIL-12 enhanced in mixed lymphocyte reaction.

MeSHdendritic cells; interleukin-12; transfection; lymphocyte transformation; mice

树突状细胞(dendritic cells,DC)迄今被认为是最重要的抗原递呈细胞, 能摄取、加工抗原并向Ⅰ类抗原限制的CTL及Ⅱ类抗原限制的CD4⁺ T细胞递呈，DC可在体内外直接激活原初（naive） T细胞^〔1,2〕。鉴于其在免疫系统中的特殊作用，DC治疗作为肿瘤治疗方案之一近来受到普遍关注。本研究从小鼠骨髓分离出单个核细胞, 加入 1×10⁶ U·L^-1 rmGM-CSF和8×10⁵ U·L^-1的rmIL-4，培养7天，获得大量具有典型DC形态的细胞。扫描电镜下观察细胞表面特征，流式细胞仪检测细胞表面分子的表达及吞噬功能。为了进一步提高DC对T细胞的作用，我们用重组腺病毒为载体介导mIL-12基因转染经GM-CSF和IL-4诱生的DC细胞，发现mIL-12转染的DC细胞较对照组更明显地激发混合淋巴细胞反应。

1材料与方法

1.1实验动物及主要试剂C57 BL/6小鼠及Balb/c小鼠：6～8周龄，♀，购自军事医学科学院动物中心(实验动物准字号：D01-031及 D01-028)。293细胞：为人胚肾细胞株，是复制缺陷型重组腺病毒载体包装细胞，由军事医学科学院吴祖泽院士惠赠。rmGM-CSF和rmIL-4及rmTNF-α：购自Peprotech公司。大鼠抗小鼠DEC205、CD86单克隆抗体及PE标记羊抗大鼠IgG：购自Serotech。PBA：含5 ml·L^-1 BSA, 200 mg·L^-1 NaN₃（质量浓度，下同）的PBS。RPMI 1640及DMEM(Gibco)完全培养液含1×10⁵ U·L^-1青霉素、1×10⁵ U·L^-1链霉素，100 ml·L^-1胎牛血清 (天津市川页生化制品研究所)；新生牛血清购自北京军区兽医站；重组腺病毒AdCMVIL-12、AdCMVLacZ粗提液（西班牙Navarra大学Dr Cheng Qian 惠赠）；³H-TdR(中国科学院原子能研究所，放射性比度0.74 GBq·mol^-1活性)；氯化铯（Boehringer mannheim）；6孔板和U形底96孔板 (Nunc)；mIL-12的ELISA 试剂盒购自Endogen公司；FITC-Dextran(Promega,相对分子量77 000)。Tris-NH₄Cl缓冲液：4.12 g Tris溶于160 ml蒸馏水，盐酸调pH至7.65,为A液。称取NH₄Cl 8.3 g溶于1 L蒸馏水，为B液。使用前B与A 9∶1体积混合，盐酸调pH至7.2。

1.2DC体外培养C57BL/6小鼠断颈处死，分离股骨，剪开股骨两头，用注射器自其一侧冲洗出骨髓细胞，离心收集细胞，加入Tris-NH₄Cl缓冲液破坏红细胞（3 ml液体可加入约10⁸个红细胞），5 min后加入PBS洗涤3次，用RPMI 1640悬浮细胞并调整细胞浓度为2.5×10^9.L^-1，置于6孔板内，37℃,5% CO₂饱和湿度下贴壁2 h，吸弃上清。用预热37℃的RPMI 1640培养基轻轻洗去非贴壁细胞，得到贴壁单核细胞。每孔加入2 ml内含rmGM-CSF1×10⁶ U·L^-1, rmIL-4 8×10⁵ U·L^-1的完全RPMI 1640培养液。 2天换液1次，补充新鲜培养基和细胞因子，于培养的第7日收集悬浮细胞。

1.3电镜观察收集的悬浮细胞用PBS洗2次，2.5%戊二醛固定，PBS洗2次，制成悬液，1%锇酸固定，4℃，30 min，梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换。CO₂临界点干燥，扫描电镜观察。由军事医学科学院仪器中心协助完成。

1.4细胞表面分子测定及吞噬功能收集细胞，用FACS标记液PBA洗2遍， 加入PBA 10倍稀释的单抗DEC205及CD86各0.1 ml，单抗标记浓度为10 mg·L^-1，置4℃标记30 min后，PBA洗2遍，加入PE标记的羊抗大鼠 IgG二抗4℃暗处标记30 min，二抗标记浓度为2 mg·L^-1，PBA洗2遍，通过流式细胞仪检测细胞表面分子。记数约10⁶，经或未经10 μg·L^-1 rmTNF-α诱导24 h的DC，用含0.5 g·L^-1 FITC-Dextran的RPMI 1640完全培养基重悬，37℃孵育细胞30 min；对照组DC置于0℃，30 min后用含PBA洗3次，流式细胞仪检测。

1.5mIL-12重组腺病毒感染培养的DC

1.5.1腺病毒的扩增、收集、纯化及滴度测定293细胞用完全DMEM培养液培养。待细胞长满至培养瓶底的70%～80%时培养基更换为含2.5 ml·L^-1新生牛血清的DMEM，加入重组腺病毒粗提液，继续培养观察48～72 h，收集呈病态反应（cytopathic effect, CPE）的293细胞,反复冻融5次，冻融液1 500 r·min^-1，离心20 min，弃细胞碎片，上清经氯化铯密度梯度2次离心浓缩腺病毒颗粒，离心产物经Hank液透析后，加入200 ml·L^-1甘油，分装后于-70℃冻存备用。病毒滴度采用噬斑分析法结合细胞病变测定法^〔3〕。

1.5.2mIL-12重组腺病毒感染DCDC培养的第7天，吸出悬浮细胞，以RPMI 1640洗2次，FACS分选DEC205阳性细胞，分别以纯化的腺病毒AdCMVIL-12和AdCMVLacZ（MOI为500）感染，37℃共同孵育4 h， RPMI 1640洗涤3次去除游离病毒, 再用含rmGM-CSF和rmIL-4的完全1640重悬细胞，继续培养48 h。

1.5.3mIL-12重组腺病毒感染DC培养上清中mIL-12含量的测定AdCMVIL-12和AdCMVLacZ重组腺病毒感染培养7天的DC, 继续培养48 h后，收集上清，按ELISA试剂盒步骤进行操作,酶标仪测定结果在标准曲线上找出对应IL-12的含量。

1.6混合淋巴细胞反应取Balb/c小鼠脾脏铜网研磨，用Tris-NH₄Cl缓冲液破坏红细胞，5 min后加入PBS洗涤细胞2次，以RPMI 1640重悬，37℃贴壁2 h，收集上清未贴壁细胞，用含200 ml·L^-1小牛血清的RPMI 1640重悬，浓度为10^10.L^-1，加至预先已用含200 ml·L^-1小牛血清的RPMI 1640浸湿的尼龙毛柱上37℃,吸附1 h后，冲洗尼龙毛柱，冲出的非吸附细胞主要是T淋巴细胞，加入96孔板,每孔10⁴个细胞。转染和未转染的DC用RPMI 1640完全培养基悬浮，浓度为5×10^9.L^-1，与丝裂霉素C 30 mg·L^-1 37℃孵育30 min后，在96孔板内分别加入10³个、10⁴个和5×10⁴个DC细胞/孔，每孔终体积200 μl，各组设3个复孔，37℃ 5% CO₂培养96 h，于培养结束前18 h每孔加入³H-TdR 37 kBq。多头细胞收集器收集细胞，液闪计数仪检测cpm值，结果以3孔均值表示。

2结果

2.1体外培养DC生成及形态从小鼠骨髓分离的单个核细胞，贴壁培养2 h，加入含rmGM-CSF 1×10⁶ U·L^-1, rmIL-4 8×10⁵ U·L^-1的完全培养基培养。加入细胞因子的第2天起，轻轻转动培养皿，小心吸去悬浮细胞。第2天即可见明显的细胞团形成；至第4～5天，细胞团体积已相当大，可见少量的悬浮细胞；培养至第6～7天，细胞团解体，大部分细胞为悬浮细胞，光镜下观察可见细胞形态不规则，有大量的突起，具典型的DC形态。培养7天的DC细胞进<