摘要目的研究IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13等Th细胞因子在体外对人T细胞趋化作用的调节。方法采用48微孔趋化板法观察不同预处理的T细胞趋化作用及Th细胞因子对T细胞趋化作用的调节效应。结果IL-1能诱导过夜培养T细胞和抗CD3单克隆抗体活化的T细胞的趋化作用，并且其趋化作用可被tyrphosin 23所抑制，IL-8则选择性吸引新鲜分离T细胞并可被staurosporine所抑制。IL-2和IL-13同时抑制CD4⁺和CD8⁺T细胞对IL-8和RANTES(regulated on activation normal T expressed and secreted)的反应，IL-4抑制CD8⁺T细胞对IL-8和RANTES的反应，IL-10只抑制CD4⁺T细胞对IL-8和RANTES的趋化作用，IFN-γ增加人T细胞对趋化因子刺激的敏感性。结论不同的细胞因子如IL-1和IL-8，通过作用于不同的信号途径来诱导不同环境下的T细胞趋化移动。而Th1和Th2细胞因子、IL-2、IL-4、IL-10和IL-13能阻断T细胞的趋化作用。

中图分类号R329.2；R392.12

文献标识码A文章编号1000-1492(2000)01-0009-05

Regulation of human T lymphocyte chemotaxis

by Th1 and Th2 cytokines

Tan Jinquan, Huang Baojun, Li Qun et al

(Dept of Immunology, Anhui Medical University, Hefei230032)

AbstractObjectiveTo study the regulation of T lymphocyte chemotaxis in vitro by Th cytokines IL-2, IFN-γ，IL-4, IL-10 and IL-13.MethodsDifferent pretreated T lymphocyte chemotaxis and the effect of regulation by Th cytokines using 48-well micro-chamber technique.ResultsIL-1 could induce chemotaxis both on overnight cultured and anti-CD3 mAb-activated T lymphocytes, which can be inhibited by tyrphosin 23. IL-8 selectively attracted freshly isolated T lymphocyte chemotaxis toward IL-8, which can be inhibited by staurosporine. IL-2 and IL-13 inhibited the chemotaxis migration of both CD4⁺ and CD8⁺ lymphocyte toward IL-8 and RANTES. IL-10 inhibited only CD4⁺ T lymphocytes in their chemotaxis response toward RANTES and IL-8. IFN-γ augments the sensitivity of human T lymphocytes to chemotaxis stimuli.ConclusionDifferent cytokines will induce chemotaxis migration of T lymphocytes under different circumstances acting through different signaling pathways. The Th1 and Th2 cytokines IL-2, IL-4, IL-10 and IL-13 are able to regulate T lymphocyte chemotaxis.

MeSHcytokines; chemotaxis

现已证明至少存在两个主要趋化因子家族分别称为α家系和β家系。IL-8是α家系的代表成员，β家系主要包括巨噬细胞炎性蛋白(MIP)和RANTES(CC趋化性细胞因子，英文全名为regulated on activation normal T expressed and secreted)。关于某些细胞因子的趋化活性，有许多有争议的报道，一些学者发现IL-1对T细胞有趋化活性，但有些学者用改良Boyden小室法未能发现^〔1，2〕。T细胞对IL-8的趋化反应最近也有学者提出疑问^〔3〕。为了解释这些争论，我们比较了不同预处理的T细胞对一些趋化性细胞因子的趋化反应，并检验了这些T细胞表面的IL-1受体的数量和亲和力的改变，通过应用特异的信号途径抑制物验证T细胞趋化作用的一些信号途径。T辅助细胞分泌许多细胞因子，其中IL-2和IFN-γ由活化Th1细胞分泌，IL-4、IL-10和IL-13主要由Th2细胞分泌。进一步了解Th细胞分泌的细胞因子对T细胞向IL-8和RANTES的趋化反应的调节，对阐明T细胞趋化作用的复杂性将有一定意义。

1材料与方法

1.1细胞因子和主要试剂IL-1和IL-8(日本Dainippon公司)；IL-2和IFN-γ(瑞士Roche公司)；IL-4、IL-10和IL-13(美国J Abrams博士和G Zurawsky博士惠赠)；FACS分析所用单抗：鼠抗人IL-1R抗体(美国Steve博士惠赠)；FITC-兔抗鼠Ab(丹麦DAKO公司)；PE-抗CD 3 mAb(美国BD公司)。

1.2T细胞亚群的分离纯化血液标本采集于健康自愿受试者(大部分为实验室工作人员，男女比例相同)T细胞亚群通过加入Dynabeads M-450(挪威Dynal公司)进行分离，Dynabeads与T细胞的比例为20∶1，混合物在4℃轻转30 min，在磁场下分离出与磁珠结合的细胞，并悬浮在HBSS/FCS缓冲溶液中，洗5次，再通过磁场移去磁珠，得到的细胞悬液保存于4℃条件下。CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞亚群通过FACS测得纯度大于99%。

1.3PKC和PTK抑制剂对T细胞趋化作用的抑制PKC抑制剂staurosporine (Sigma公司产品)和PTK抑制剂tyrphostin 23 (Sigma公司产品)配制成浓度范围从0.1 μg·L^-1到10 μg·L^-1，与T细胞一起在37℃下孵育45 min，细胞用10% FCS-HBSS洗3次并悬浮于10% FCS-RPMI 1640中4℃ 1 h，检查成活细胞大于97%，用于趋化作用试验。

1.4Th1和Th2细胞因子对T细胞趋化作用的调节IL-2和IFN-γ配制成浓度范围从0.1 μg·L^-1到1000 μg·L^-1，IL-4和IL-13浓度范围从0.01 μg·L^-1到100 μg·L^-1，IL-10浓度范围从0.001 μg·L^-1到10 μg·L^-1，分别与T细胞一起，37℃培养30 min，然后做趋化实验。IL-4、IL-10、IL-13对T细胞趋化移动调节效应的阻断分别用其相关抗体(10 mg·L^-1)，37℃培养30 min。

1.5T细胞趋化作用试验采用48微孔趋化板法，趋化因子用0.5% BSA-RPMI 1640稀释放置25μl于下室内；上室加入T细胞或其亚群，浓度为5×10^9.L^-1， 50 μl，中间隔以5 μm孔径的多碳膜。在37℃ 5% CO₂中培养120 min后，取出膜，用70%甲醇固定，考马斯亮蓝染色5 min。通过显微镜上的照像机连接到记算机系统计数膜下表面的细胞数，记算趋化指数(CI， Chemtactic Index)，CI=测试区平均细胞数/对照区平均细胞数。

图1各种状态T淋巴细胞表面白介素-1受体流式细胞术分析

A：新鲜分离的T细胞，表面IL-1受体阳性的细胞只为0.12%；B：过夜培养的T细胞，表面IL-1受体阳性的细胞为62.21%；C：抗CD3单抗活化的T细胞，表面IL-1受体阳性的细胞为70.21%

1.6T细胞IL-1受体检测新鲜分离、过夜培养抗CD3 mAb活化的T细胞分别与鼠抗人Ⅰ型IL-1受体的抗体一起孵育30 min，然后与FITC兔抗鼠抗体孵育，10%鼠血清封闭，最后细胞与PE鼠抗人CD3单克隆抗体孵育，标记的细胞用1%多聚甲醛固定，用流式细胞仪FACStar plus(美国BD公司)进行测定。

1.7数据统计分析结果应用t检验分析。

2结果

2.1IL-1和IL-8的不同预处理T细胞的趋化活性分析

2.1.1IL-1对T细胞的趋化活性我们观察到过夜培养的T细胞和抗CD3单克隆抗体活化的T细胞对IL-1的刺激有反应，IL-1的浓度达到100 μg·L^-1时，过夜培养的T细胞趋化指数(CI)=2.68±0.91，抗CD3单克隆抗体活化的T细胞CI=2.91±0.97，新鲜分离的T细胞CI=1.38±0.41，统计结果差异有显著性，P值分别小于0.01和0.001。

2.1.2IL-8对T细胞的趋化活性新鲜分离的T细胞对IL-8的刺激有反应(CI=2.86±0.90， P＜0.01)，过夜培养的T细胞和抗CD3单克隆抗体活化的T细胞未显示对IL-8的趋化移动(CI分别为1.44±0.31，1.34±0.70，P＞0.05)。Checkerboard分析证明IL-8和IL-1可引起T细胞趋化移动，而不是化学促活移动(结果未列出)。

2.2过夜培养和抗CD3单克隆抗体活化对T细胞表面IL-1受体的调节我们通过FACS分析检查了T细胞表面Ⅰ型IL-1受体的表达，结果表明新鲜分离的T细胞表面很少表达IL-1受体(受体阳性的细胞仅为0.12%)，过夜培养和抗CD3单抗活化，IL-1受体在T细胞表面的表达显著增加，其IL-1受体阳性细胞分别为62.21%和70.21%，这也是T细胞经过夜培养和抗CD3单抗活化后，表现出对IL-1的趋化作用的原因之一。见图1。

2.3PKC抑制剂和PTK抑制剂对T细胞向IL-1和IL-8趋化作用的抑制效应结果显示staurosporine(PKC抑制剂)能抑制新鲜分离的T细胞对IL-8的趋化作用，tyrphosin23(PTK抑制剂)能显著抑制过夜培养的T细胞向IL-1的趋化作用(图2)和抗CD3单抗活化T细胞向IL-1的趋化作用(图2)。结果表明IL-1诱导T细胞趋化作用受PTK信号途径调控，IL-8则可能激活PKC信号途径。

2.4Th细胞因子对T细胞向IL-8和RANTES趋化作用的调节

2.4.1IL-13对T细胞向IL-8和RANTES趋化作用的调节结果表明IL-13是T细胞向IL-8和RANTES趋化作用的强抑制剂。当IL-13(1 μg·L^-1)与T细胞一起孵育30 min，能显著地