摘要目的建立血管紧张素转换酶（ACE）基因型的分型方法，了解正常汉族女性ACE基因的多态性及频率分布。方法应用多聚酶链反应（PCR）对30例正常汉族女性ACE基因进行分型并介绍该实验方法和操作。结果正常汉族女性ACE基因有II(插入型)、DD(缺失型)、DI(杂合子)三种基因型，分别占56.7%、10%、33.3%,I等位基因频率为73.3%,D等位基因频率为26.7%。结论PCR是检测ACE基因多态性的一种快速、简便的方法。

中国图书资料分类法分类号R392.2；R345

Polymorphism of the angiotensin-converting anzyme

in normal Chinese women

Cao Yunxia，Zhuang Guanglun， Wang Yuan et al

(Dept of Grynecology and Obstetrics,The First Affiliated

Hospital of Anhui Medical University,Hefei230022)

AbstractObjectiveTo establish a genotyping methodfor angiotensin-converting enzyme (ACE) gene and detect insertion/deletion (I/D)polymorphism of ACE in normal Chinese women.MethodsPolymerase chain reaction (PCR) technique were employed to typing ACE gene of 30 normal women.ResultsThe distribution of the II、DI、DD genotypes were 56.7%、33.3% and 10% respectively. The frequency of the I allele was 73.3%, and D allele 26.6%.ConclusionPCR technique is a rapid and simple method to detect polymorphism of ACE gene.

MeSHpeptidyl-dipeptidase A; polymorphism/genetics; polymerase chain reaction;han nationality; female

血管紧张素转换酶（ACE）是肾素-血管紧张素系统的关键酶，它使血管紧张素Ⅰ（AT_Ⅰ）转换为血管紧张素Ⅱ（AT_Ⅱ）而发挥作用。目前研究表明：肾素-血管紧张素系统（RAS）功能亢进，与女性多囊卵巢综合症（Pcos）及与此相关的非胰岛素依赖性糖尿病（NIDDM）和心血管疾病密切相关，ACE是这一系统的关键酶，此酶受控于ACE基因，因此，将ACE基因作为候选基因进行研究。ACE基因位于人染色体17q23,其第16内含子中存在一段长度为287bp的插入片段，由于此片断的插入和缺失（I/D）,产生Ⅱ(插入型)、DI(杂合子)及DD(缺失型)三种基因型^〔1〕。本研究采用PCR方法对30例正常女性ACE基因多态性进行检测，以了解ACE基因型在正常女性中的分布情况。

1资料与方法

1．1主要试剂和仪器引物（由Life Technologies 公司合成）， TaqDNA，dNTP,MgCl₂,PCR缓冲液，蛋白酶K,DNA Marker(购自华美生物工程公司)，Hema 480基因扩增仪（珠海黑马医学仪器有限公司产品）。

1.2研究对象30例标本取自安徽医科大学附院健康志愿者，年龄19～38岁，未婚10例，已婚并生育20例，体重指数（BMI=体重/身高²）＜25，血压及月经周期正常，无多毛、痤疮，无糖尿病及心血管病家族史，无内分泌疾病，均为汉族。每人取全血5 ml放入肝素钠抗凝管中备用。

1.3实验方法

1.3.1模板DNA的制备将抗凝血4 000 r·min^-1离心5 min,吸取白细胞层以低渗溶血法^〔2〕去除红细胞,离心得白细胞,将白细胞沉淀溶解在100 μl的DNA缓冲液(KCl,Tris-HCl,MgCl₂,NP 40,Tween 20,蛋白酶K)中, 55℃孵育3 h, 95℃灭活10 min。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀基因组DNA，干燥后溶于100 μl d H₂O中备用。

1.3.2PCR反应参照Tiret等^〔3〕引物设计方法，正义寡核甘酸引物序列：5′CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT 3′，反义寡核甘酸引物序列：5′GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT 3′。采用25 μl反应体系，在100 ng标本DNA模板液中分别加入PCR反应液（10 mmol·L^-1 Tris,50 mmol·L^-1 KCl,2 mmol·L^-1 MgCl₂,200 mmol·L^-1dNTPs,0.5 μmol·L^-1引物及Taq DNA聚合酶）。置Hema480基因扩增仪中，97℃预变性5 min；95℃变性1 min；60℃退火1 min；72℃延伸1 min，共35个循环。

1.3.3PCR产物的检测取PCR产物8 μl, 加入含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳（60 mV,30 min）,经紫外透射下检测，PCR Marker作为参照，进行多态性分析。

2结果

正常女性ACE基因型共3种，见图1。

^*在300 bp处一条暗带可能为非特异性扩增所致

1纯合子插入型（II）: 在490bp处出现一条带，纯合子缺失型（DD）:在190bp处出现一条带，杂合子（DI）:在490bp及190bp处分别出现一条带（两条带）

统计结果分析：II型17例，频率为56.7%, DI型10例，频率为33.3%, DD型3例，频率为10%，I等位基因频率为73.3%, D等位基因频率为26.7%。

3讨论

正常人ACE D、I等位基因频率有明显的种族差异，在意大利、挪威等国家，D型约占54%，I型约占46%^〔4〕。亚洲人，I型所占比例相对较高，日本人D型占31%，I型占69%^〔5〕。我们研究结果，正常汉族女性ACE基因型中以II型为多（56.7％），I等位基因频率占73.3%，D等位基因频率占26.7%,与日本人相近。

1990年Rigat等^〔6〕首先观察到了ACE基因多态性与血清血管紧张素转换酶(sACE)间的关系，此后陆续有报道ACE基因多态性与心血管疾病的关系,尤其是D等位基因可能是冠心病、高血压病发病的危险因子^〔7〕。在多囊卵巢综合征（Pcos）病人，表现为RAS功能亢进^〔8〕，其活性物质（AT_Ⅱ）调节卵巢性激素合成，主要表现为睾酮（T）和孕酮（P）增加，雌二醇（E₂）下降，即促进高雄激素血症形成，引起卵泡发育障碍，且研究已表明Pcos标志着非胰岛素依赖性糖尿病（NIDDM）的一个主要危险因素，将来有更大的危险性发展成心血管疾病。因此，我们建立正常汉族女性ACE基因多态性研究的方法，对进一步研究ACE基因多态性与Pcos病人不排卵及高雄激素血症的关系, 尤其是早期预测及预防由Pcos引起的NIDDM 及心血管疾病都有重大意义。

作者简介：曹云霞，女，36岁，博士生，副主任医师，副教授；

庄广伦，男，62岁，博士生导师，教授

参考文献

1Rigat B, Hubert C, Corvol P et al. PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin-converting enzyme gene. Nucl Acids Res, 1992；20(5):1433

2王申五主编. 基因诊断技术. 北京: 北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社, 1992:36～37

3Tiret L, Riget B, Visviks S et al. Evidence, from combined segregation and linkage analysis, that a variant of the angiotensin-Ⅰ-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels. Am J Hum Genet, 1992；51(1):197～200

4Cambien F, Poirier O, Lecerf L et al. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature, 1992；359(6396):641

5Furuya K, Yamaguchi E, Itoh A et al. Reevaluation of serum enzyme levels in sarcoidosis by a polymorphism of the angiotensin-Ⅰ-converting enzyme gene (Abstract). Am Rev Respir Dis, 1993；147(5):A787

6Rigat B, Hubert C, Alhens-Gelas F et al. An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin-Ⅰ-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J Clin Invest, 1990；86(4):1343～1347

7Mattu PK, Needbam EWA, Galton DJ et al. A DNA variant at the angiotensin-converting enzyme gene locus associates with coronary artery disease in the Caerphilly Heart Study. Circulation， 1995；91(2):270～273

8Morris RS, Wong IL, Hatch IE et al. Prorenin is elevated in polycystic ovary syndrome and may reflect hyperandrogenism. Fertil Steril, 1995；64(6):1099～1103

1999-06-08收稿，1999-09-14修回