摘要目的建立体外肝细胞坏死性损伤模型，为进一步研究药物对体外肝细胞损伤的保护作用奠定基础。方法采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝实质细胞并进行体外培养，利用四氯化碳（CCl₄）和过氧化氢（H₂O₂）体外诱导肝细胞坏死性损伤，检测ALT、AST、MDA、GSHpx等指标和采用MTT比色法。结果CCl₄体外诱导肝细胞损伤的最适损伤浓度和损伤时间为：8 mmol·L^-1，6 h；H₂O₂体外诱导肝细胞坏死性损伤的最适损伤浓度和损伤时间为0.6 mmol·L^-1，1 h。结论利用最适损伤浓度的CCl₄和H₂O₂分别与大鼠肝细胞共培养最适损伤时间，可建立两种理想的体外肝细胞坏死性损伤模型。

中国图书资料分类法分类号R332；R575

Establishment of necrotic injured models of

primary hepatocytes from rats

Yang Yan, Chen Minzhu

(Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei230032)

AbstractObjectiveTo establish the nectotic injured models of hepatocytos in vitro for further studying protective effects of drugs on injured hepatocytes.MethodsThe hepatocytes were isolated by perfusion of liver with Ⅳ type collagenase in rats and incubated with CCl₄ or H₂O₂. The necrotic hepatocytes induced by CCl₄ or H₂O₂ were investigated by measuring the levels of AST and ALT, the amount of MDA and the activity of GSHpx, and MTT colormetry.ResultsThe most optimal injured conditions of CCl₄ or H₂O₂ were separately determined as CCl₄: 8 mmol·L^-1, 6 h; H₂O₂: 0.6 mmol·L^-1, 1 h.ConclusionTwo kinds of necrotic injured models of hepatocytes may be created separately by the most optimal injured conditions of CCl₄ or H₂O₂.

MeSHliver/cytology; cells; culture, disease models, animal; rats

在我国肝炎为常见病多发病，目前尚无令人满意的治疗方法。本实验采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝实质细胞、进行体外培养，并建立四氯化碳（CCl₄）和过氧化氢（H₂O₂）体外诱导肝细胞坏死性损伤的模型，选择CCl₄和H₂O₂的最适损伤浓度和损伤时间，为进一步研究药物对体外肝细胞损伤的保护作用奠定基础。

1材料

1.1动物SD大鼠，体重180～250 g，♀♂不拘，由安徽医科大学实验动物中心（皖医实动准字第01号）提供。

1.2主要试剂Ⅳ型胶原酶（Sigma公司），RPMI1640培养基粉（Gibco公司），HEPES（Sigma公司），小牛血清（由本校微生物教研室提供），CCl₄（安徽省蚌埠电化试剂厂，批号：940903），H₂O₂（上海桃浦化工厂，批号：950616），MTT（上海生化试剂公司进口分装），还原型谷胱甘肽（GSH，上海试剂三厂），二硫代2硝基苯甲酸（DTNB，Sigma公司），ALT、AST检测试剂盒（上海捷门生化试剂公司），硫代 比妥酸（TBA，上海试剂二厂，批号：9304），三氯醋酸（TCA，上海试剂三厂），1，1，3，3-四乙氧基丙烷（tetraethoxypropane, TEP）。

1.3主要仪器GLY-I型脏器灌流仪（北京真空仪表厂），Napco-6100型CO₂培养箱（美杜帮公司），751分光光度计（上海分析仪器厂），GL20A型全自动高速冷冻离心机（湖南离心机厂），EL-301型酶联免疫检测仪（美国产）。

2方法

2.1大鼠肝细胞的分离和培养参照文献^〔1〕并加以改良。大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O₂的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min^-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，10⁵U·L^-1青霉素，100 mg·L^-1链霉素和10 mg·L^-1胰岛素）制成1×10⁹个·L^-1肝细胞悬液^〔2〕。分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法^〔3〕鉴定99％为肝实质细胞。

将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。

2.2CCl₄诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立^〔4，5〕肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl₄〔（1～16mmol·L^-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备CCl₄诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。

2.3H₂O₂诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立^〔6〕同法更换培养液，加入不同浓度的H₂O₂（0.2～3.2 mmol·L^-1），作用不同时间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备H₂O₂诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。

2.4检测指标

2.4.1AST、ALT的测定培养的肝细胞经离心（1 800 r·min^-1，10 min）后收集上清，按试剂盒说明书步骤测定上清液中AST和(或)ALT活性，结果以U·(10⁶ cell)^-1表示。

2.4.2肝细胞增殖试验采用MTT比色法^〔7〕。

2.4.3肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）活性的测定参照文献^〔8〕先制备GSH标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入0.2％ Triton-100水溶液0.5 ml，混匀，2 min后，离心（2 500 r·min^-1，10 min），取上清液（肝细胞样品）0.4 ml，另设样品空白管，非酶反应管和试剂空白管，按参考文献^〔8〕操作顺序加入各种试剂。混匀后立即计时，静置12 min后，以样品空白管调零点，于423 nm波长处读得吸光度（A）值。在GSH标准曲线上查出对应的GSH波度。GSHpx酶活力单位是在37℃，pH6.5条件下，每10⁶个肝细胞、每分钟使GSH浓度下降1 μmol为1个酶活力单位。计算公式为：GSHpx活力单位=（［GSH］_非酶管-［GSH］_样品管-［GSH］_{试剂空白管}）/3。结果以U·(10⁶ cell)^-1表示。

2.4.4肝细胞丙二醛（MDA）含量的测定^〔9〕先制备MDA标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入生理盐水1 ml，混匀，移入离心管中，离心（2 500 r·min^-1，10 min），弃上清，加15％ TCA 2 ml，破坏细胞并沉淀蛋白质，加入0.67％ TBA 2 ml，于沸水浴中加热30 min。根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对应的浓度，结果以 nmol·(10⁶ cell)^-1表示。

2.5数据处理数据以±s表示，计量资料组间比较采用t检验。两变量间相互关系，采用直线相关和回归分析。

3结果

3.1CCl₄诱导大鼠肝细胞损伤的量效与时效曲线不同浓度CCl₄（1、2、4、8和16 mmol·L^-1）与原代肝细胞作用6 h，检测各项指标（表1）。结果表示，随CCl₄浓度的增大，反映肝细胞增殖的MTT反应明显抑制，肝细胞的MDA增多和GSHpx下降，但培养上清中AST逐渐升高。根据CCl₄损伤大鼠肝细胞的量效曲线（表1、图1），我们选择8 mmol·L^-1 CCl₄为最适损伤浓度。将8 mmol·L^-1 CCl₄加入培养的原代肝细胞中，作用1和3 h，AST和GSHpx均无明显变化，作用6 h，AST释放明显增多，而细胞内GSHpx明显减少，作用12 h，培养上清中AST继续增高，但肝细胞的GSHpx已不再下降。根据CCl₄损伤大鼠肝细胞的时效曲线（表2、图2），我们选择6