摘要目的了解痰标本检测肺癌患者p53基因突变的可行性及其对临床诊断的意义。方法采用改良Saccomanno法浓缩及保存痰标本，部分涂片找癌细胞，其余标本进行痰细胞DNA提取及多聚酶链反应(PCR)-单链构象多态性分析(SSCP)。共检测22例患者，其中确诊肺癌患者15例(涂片或活检找到癌细胞)，临床高度怀疑肺癌患者5例(涂片或活检均阴性)，2例非肿瘤患者(1例为结节病，另1为右中叶肺炎)，同时采用正常肺组织标本作对照。结果p53外显子6、7、8的PCR-SSCP银染阳性率在肺癌组及癌疑组分别为6/15(40%)和2/5(40%)。非肿瘤患者痰标本及正常肺组织均未发现p53基因异常。结论改良Saccomanno法不仅能贮存、浓缩痰细胞，而且方便痰标本DNA提取；PCR-SSCP银染方法可用来检测肺癌患者痰细胞的p53基因突变。

中国图书资料分类法分类号R734.2

Detection of p53 gene mutation in preserved sputum

with PCR-SSCP for diagnosis of lung cancer

Cao Lejie¹, Li Longyun², Guo Zijian² et al

(¹Anhui Provincial Hospital, Hefei230001;²Peking Union Medical Hospital,100730)

AbstractObjectiveTo screen for p53 abnormalities of sputum samples in lung cancer patients and value in early diagnosis of lung cancer.MethodsThe modified Saccomannos concentration method was carried in preservd sputum samples and the polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) analysis was used for p53 gene investigation. By examining 22 sputum samples (15 from confirmed lung cancer patients, 5 from clinically suggestible lung cancer patients, 1 from sarcoidosis patient and 1 from right central pneumonia patient) and normal lung tissues as control.ResultsTen samples from 22 patients had positive tumor cells and the mean DNA concentration of preserved sputum samples was (1.88±1.49) g·L^-1, which OD_{260 nm}/OD_{280 nm} was 1.61(40%) preserved sputum specimens (6 from 15 confirmed lung cancer patients, 2 from 5 clinic suggestible lung cancer patients without pathological evidences) had been found p53 gene abnormalities. Two non-lung tumor sputum samples and 1 normal lung tissue had not been found any p53 gene abnormality.ConclusionThe preserved sputum samples of the modified Saccomannos method is very important prearrangment for p53 gene investigation. PCR-SSCP analysis of sputum samples is successful in detection of p53 gene abonormalities of lung cancer patients and the p53 abnormalitis of clinical suggestible lung cancer without pathologic evidences indicate p53 abnormalitis earlier than other diagnostic method, which may serve as a early diagnosis method of lung cancer.

MeSHlung neoplasms; sputum; genes p53 mutation; sliver staining

近年来，肺癌发病率持续上升，已居国内部分大城市恶性肿瘤的首位，而致死率又居高不下，提高肺癌早期诊断率，增加手术成功率，降低死亡率成为国内外学者研究的热点。传统的痰细胞学检查及胸片普查并不能达到早期诊断、降低死亡率的目的^〔1〕。p53基因是人类重要的抑癌基因，p53基因突变或缺失可引起生长失控形成肿瘤。肺癌具多基因异常，p53基因异常见于70%～90%小细胞肺癌及47%非小细胞肺癌，是常见、高发的基因异常^〔2〕。而肺癌的发生存在一个形态局部变化、发展的过程。基因及免疫组化分析显示癌前气管病灶即出现p53基因突变。p53蛋白免疫组化染色显示p53蛋白累积在正常支气管粘膜0，鳞状化生7%，轻度不典型增生25%，原位癌57%，显微镜下侵犯癌70%，76%在全层侵犯癌；即25% p53基因点突变发生于极早期肿瘤，大部分突变亦在肿瘤侵犯进展期前出现，故早期痰液和纤支镜标本p53基因检测可能是早期诊断肺癌的重要途径^〔3〕。聚合酶链-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)银染检查是常用的检测p53基因突变、缺失的方法^〔4〕。我们通过PCR-SSCP银染检测肺癌患者、临床疑诊肺癌患者、非肿瘤患者痰标本及正常肺组织标本，以了解PCR-SSCP银染方法检测痰标本p53基因异常的可行性及对肺癌的诊断意义，寻求以p53基因检测早期诊断肺癌的理论依据。

1材料与方法

1.1痰标本收集与处理采用Saccomano^〔5〕法收集痰标本。用50 ml内壁硅化的离心管留痰。每管内盛含2%聚乙二醇及50%乙醇的固定液30 ml，给病人两管连续留2天痰液。病人咳痰前用生理盐水或凉开水清洁口咽部，弃去第一口痰，留取24 h的深部痰液5～10口。痰量少时可留2～3天痰液于1管，痰量多时可1天留2管。每咯一口痰于离心管内后立即盖紧盖子用力摇动试管以利固定。

收集的痰标本加入10%粘痰松解剂(协和医院自制)静置5 min，后再用力摇动至管底自然出现沉淀为止。1 500 r·min^-1离心5 min，弃上清。将管底沉淀物用吸管轻轻抽吸，混匀后吸出3～4滴于玻片涂片染色，痰细胞学检查。剩下痰液转入1.5 ml Eppendorf管内予编号，保存于-20℃冰箱(短期保存)或-70℃冰箱(长期保存)备用。

1.2正常肺组织系安徽省立医院急性肺外伤手术标本。新鲜组织取出后置于液氮内，后贮存于-70℃冰箱。该患者术前无肺部疾患及嗜烟史。

1.3DNA提取

1.3.1痰标本DNA提取贮痰标本5 000 r·min^-1离心5 min,弃上清；加PBS 1 ml洗涤2次，5 000 r·min^-1离心弃上清后加0.5 ml DNA提取液37℃温育1 h，加蛋白酶K 5～10 μl(20 g·L^-1)50℃孵育4 h，经饱和酚、氯仿/异戊醇抽提，10 mol·L^-1醋酸氨及预冷无水乙醇沉淀，再经70%乙醇漂洗2次，5 000 r·min^-1离心，使沉淀下底移弃上清液，加TE 25～50 μl 4℃过夜后存于-20℃冰箱。

1.3.2肺组织标本DNA提取取组织块，剪碎后采用上述方法提取DNA。

1.4PCR-SSCP银染法1 μl痰DNA标本加入25 mmol·L^-1 MgCl₂ 2 μl， 10×Buffer 2.5 μl Taq酶1 μl，2.5 mmol·L^-1 dNTP 2.0 μl(前4种均为Promega公司产品)，外显子6～8引物2 μl(外显子左右各1 μl)，加去离子水至25 μl。经95℃预变性8 min后，于94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min共35个循环，后72℃延伸10 min。PCR产物于-20℃保存。PCR仪系美国ERICOMP Inc产品(TWINBLOCK SYSTEM)。外显子引物由中国协和医科大学基础医学研究所提供，外显子引物序列为：

EXON 6扩增130 bp

p53-6R

5′-GATTGCTCTTTAGGTCTGGCCCCTCCTCAGC-3′

p53-6L

5′-CAGACCTCAGGCTCATAGG-3′

EXON7扩增118 bp

p53-7R

5′-CTAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCC-3

p53-7L

5′-TGACCTGGAGTCTTCCAGTGTG-3′

EXON 8扩增141 bp

p53-8R

5′-GTAGTGGTAATCTACTGGGAACGGAACAGC-3′

p53-8L

5′-CTCGCTTAGAGCTCCCTGGGGGG-3′

取14 μl PCR产物加去离子甲酰胺变性液16 μl，混匀后于97℃变性8 min迅速置于冰洞或碎冰降温，加样于8%聚丙烯酰胺垂直电泳胶上，采用PBR 322/Hinf I为参照物，1X TBE为缓冲液，4℃冰箱内500V电泳3 h，轻柔取下胶于避光染色缸内0.1%硝酸银染后后观察结果。电泳仪系北京六一仪器厂生产的ECP 3000多用电泳仪及配套的DYY-Ⅲ 28 B型夹心式直式电泳槽。

2结果

15例确诊肺癌患者、5例临床怀疑肺癌患者、2例非肿瘤患者的22份痰标本(取自两医院)接受检查。患者年龄47～74岁，平均62岁。有长期吸烟史(指数＞400年支)者16例，不吸烟者6例。男性17例，女性5例。确诊的肺癌组织学类型分别为：鳞癌7例，小细胞癌4例，腺癌1例。癌疑2例，下咽癌肺转移1例(亦为鳞癌)。详见表1。

改良Saccomanno法浓缩找癌细胞：15例确诊肺癌患者10例痰细胞学检查出癌细胞(占66.7%)，5例临床怀疑肺癌患者及2例非肿瘤患者痰细胞学阴性。浓缩法细胞密集，痰细胞学形态不受影响。

表122例痰细胞DNA p53 PCR-SCP结果与临床病理诊断比较

组别 例数 PCR-SSCP P值 阳性(%) 阴性(%) 男性 17 6(35) 11(65) ＞0.05