摘要：目的比较提取表皮下大疱病相关抗原的三种分离皮肤方法。方法采用盐裂法、EDTA分离法、热分离法提取真、表皮抗原，免疫印迹检测提取物中抗原的活性，结果三种方法均可用于SABD抗原的提取，但热分离法在所提取抗原的敏感性上明显优于其他两种方法。结论热分离法对抗原活性影响最小，值得优先选择和运用。

中国图书资料分类法分类号：R382.11；R758.66

Comparison of three techniques of separating skin

for extracting antigens related to SABD

Yang Sen, Zhang Xuejun, Wang Zaixing et al

(Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital,Anhui Medical University,Hefei230022)

AbstractObjectiveTo compare three methods extracting antigens related to SABD from human skin.MethodsThree techniques of 1 mol^．L^-1 NaCl, 0.1 mol^．L^-1 EDTA and heat-separated skin were used to isolate dermal and epidermal antigens. The activity of antigens from extract was detected by immunoblotting.ResultsThree techniques might extract SABD antigens, but the sensitivity of antigens from heat-separated skin was higher than the other two.ConclusionHeat seperation technique produces the least influence on antigen activity and is the first choice.

MeSHskin diseases, vesiculobullous; antigens

利用两种盐裂皮肤免疫荧光方法（IIF、DIF）确诊的大疱性类天疱疮（BP）、线性IgA大疱病（LAD）、大疱性系统性红斑狼疮（BSLE）和获得性大疱性表皮松解症（EBA）血清，免疫印迹（IB）检测盐裂法、EDTA分离法和热分离法提取的表皮和真皮抗原，比较三种方法提取表皮下自身免疫性大疱病（SABD）相关抗原的敏感性，观察三种方法对SABD抗原活性的影响。

1材料与方法

1.1材料所有病例来自我科收住院的SABD病人，经IIF、DIF确诊，其中BP 10例，EBA 3例， BSLE 3例，LAD 3例。

1.2方法

1.2.11 mol^．L^-1 NaCl盐裂皮肤法^〔1〕取尸检皮肤去除皮下脂肪，置于1 mol^．L^-1 NaCl溶液中，4℃，72 h连续搅拌。分离真、表皮，表皮置盐裂皮肤表皮提取液（31.2 mmol^．L^-1 Tris-HCl，含2％SDS， 0.1 mol^．L^-1 DTT，1 mmol^．L^-1 PMSF，2 mmol^．L^-1EDTA， pH6.8）中，组织匀浆，4℃超声破碎30 s×3次。真皮置盐裂皮肤真皮提取液（12.5 mmol^．L^-1 Tris-HCl，含8 mol^．L^-1尿素，0.1 mol^．L^-1 DTT， 1 mmol^．L^-1 PMSF， 2 mmol^．L^-1，EDTA pH6.8）中，室温下震荡1 h。表皮和真皮处理液离心，10 000 r^．min^-1， 18℃, 1 h。分别收集上清液，即为表皮抗原提取物与真皮抗原提取物，-50℃保存。

1.2.20.1 mol^．L^-1EDTA分离皮肤法^〔2〕取尸检皮肤置0.1 mol^．L^-1EDTA溶液（0.1 mol^．L^-1 EDTA， 1 mol^．L^-1 NaCl， 50 μmol^．L^-1 PMSF）中，4℃，72 h连续搅拌，分离真、表皮。表皮和真皮分别放于EDTA分离皮肤法的抗原提取液（8 mol^．L^-1尿素，0.1 mol^．L^-1EDTA， 50 μmol^．L^-1PMSF， 0.3 mol^．L^-12ME）中，4℃过夜，摇动。过滤处理，分别收集滤液，即为表皮抗原和真皮抗原提取物，-50℃保存。

1.2.3热分离皮肤法^〔3〕取正常人皮肤，去除皮下脂肪，削至0.5 mm左右厚度，冷生理盐水反复冲洗，将皮肤切成2 cm×2 cm大小，放入37℃热分离皮肤缓冲液中10 min，后放入56℃热分离皮肤缓冲液中40 s，迅速冷却，用手术刀背轻轻分离表皮和真皮。表皮放入热分离表皮提取液（65 mmol^．L^-1 Tris-HCl，含2 mmol^．L^-1PMSF， 10 mmol^．L^-1 EDTA， 10 mg^．L^-1pepstatin, 10 mg^．L^-1 antipain, 10 mg^．L^-1 leupeptin, 10 mg^．L^-1 chymostotin, 2% SDS, pH6.8）中，4℃环境组织匀浆，匀浆液置塑料离心管液氮中反复冻融10 min×3次。真皮充分剪碎放入热分离真皮提取液（25 mmol^．L^-1 Tris-HCl, 含8 mol^．L^-1尿素，5％ 2ME， 10 mmol^．L^-1 PMSF，10 mmol^．L^-1 EDTA， 2％SDS， pH6.8）中，37℃震荡1 h。表皮和真皮处理物离心，15 000 r^．min^-1，8℃，30 min，收集上清液再重复离心一次。分别收集上清液，即为热分离表皮抗原提取物和真皮抗原提取物，-50℃保存。

1.2.4免疫印迹法^〔4〕采用7.5％分离胶和4％浓缩胶。人表皮抗原提取物经SDS-PAGE和转移电泳，将抗原转印至硝酸纤维膜（NC）上。NC置于0.1％ Tween-20-5%BSA-PBS中封闭5 h，切成3 mm宽，置于反应槽内，加入经血清稀释液（50 mmol^．L^-1 Tris-ΗCl, pH 7.4，含0.5 mol^．L^-1 NaCl, 0.5% BSA, 0.3％ Tween-20）1∶10稀释的待检血清，室温平缓摇动4 h，倾去反应液，用洗涤液（10 mmol^．L^-1 Tris-HCl, pH7.4, 含0.5 mol^．L^-1 NaCl, 0.3% Tween-20）漂洗10 min×4次，加入按1∶400稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体（Sigma产品）或兔抗人IgA抗体（Sigma产品）室温平缓摇动1 h，倾去反应液，用洗涤漂洗10 min×4次，甩干后加入新配制的DAB底物液（0.6 g^．L^-1DAB，0.03％H_２O_２），观察出现较明显区带后用双蒸水冲洗终止反应。与标准标准蛋白对照，计算阳性条带分子质量的大小。

2结果

从表从表1可以看出，三种分离法可提取真皮290 ku抗原，盐裂法和热分离法可提取230 ku和165 ku的BP抗原，但热分离法还提取200 ku、180 ku、130 ku、115 ku和97 ku抗原，并提取与LAD血清中IgA型抗体结合的真皮和表皮115 ku和97 ku抗原。EDTA法未提出BP抗原和LAD相关抗原，盐裂法也未提出LAD相关抗原。对照血清阴性反应。

表1三种分离法提取SABD抗原结果比较

例数(n) 盐裂法(例数) EDTA分离法(例数) 热分离法(例数) 表皮抗原 真皮抗原 表皮抗原 真皮抗原 表皮抗原 真皮抗原 BP 10 230 ku(6)

230 ku(4) 165 ku(4) 200 ku(1) 180 ku(1) 165 ku(6) 130 ku(1) 115 ku(1) 97 ku(1) EBA 3 290 ku(3) 290 ku(2)

290 ku(3) BSLE 2 290 ku(1) 290 ku(1) 290 ku(1) LAD 2 115 ku(2) 115 ku(1) 97 ku(2) 97 ku(1)

3讨论

分离人皮肤真、表皮技术有多种，在研究分离人皮肤真、表皮技术有多种，在研究SABD相关抗原时，为了制备表皮和真皮抗原，多采用1 mol^．L^-1 NaCl盐裂法、负压吸疱法、EDTA分离法和热分离法等^〔5〕。本文比较1 mol^．L^-1 NaCl法、EDTA法和热分离法三种方法提取SABD相关抗原的敏感性，除热分离法制备表皮抗原过程按文献方法加以修改，其余方法均按文献进行。

0.1 mol^．L^-1 EDTA分离真表皮所提取的表皮抗原和真皮抗原进行IB检查，BP血清未见与表皮提取物反应，也未见LABD血清与真皮提取物中285 ku抗原反应，Wojnarowska^〔6〕实验结果认为285 ku抗原为LAD抗<