摘要：目的建立一种适用于检测人巨细胞病毒（HCMV）感染新生乳鼠大脑皮质神经元原代培养物中病毒DNA的原位杂交法。方法制备和培养新生乳鼠大脑皮质神经元并进行病毒感染；在感染后的第3，5天及第1～4周连续取样用地高辛标记的HCMV即刻早期抗原（MIE）和晚期抗原（LA）寡核苷酸特异性探针分别进行核酸原位杂交，检测受染神经元内相应病毒核酸及分布。结果MIE寡核苷酸探针可在HCMV感染后第4～7天检出神经元核内HCMV DNA；而LA寡核苷酸探针则可稳定地检出感染后第7～28天细胞培养物中的相应病毒核酸；并显示：HCMV DNA杂交阳性信号在感染的早期主要分布在核内，呈灶性；而在感染的晚期，杂交阳性信号均匀分布于受染神经元的核内及胞浆内。结论地高辛标记的HCMV DNA MIE和LA寡核苷酸探针在病毒感染机制研究以及临床诊断等方面，具有广泛的应用前景。

中国图书资料分类法分类号：R977； R512.99； R373.9； R392

Application of digoxigenin-labelled probe in the study

of the neurons of newborn mice from the cerebral cortex

with human cytomegalovirus infection

Wang Mingli, Shi Baifen, Li Jingpei et al

(Department of Microbiology, Anhui Medical University, Hefei230032)

AbstractObjectiveTo develop an appropriate method of in situ hybridization using digoxigenin (Dig)-labelled oligodeoxynucleotide probes for detection of human cytomegalovirus (HCMV) DNA in the primary cultured neurons of newborn mice from the cerebral cortex.MethodsThe cerebral cortex neurons were prepared and cultured and HCMV infection model was made. The cells were observed and recorded by photography under microscope, and the cell samples were taken for the viral DNA detection and its intracelluar location was analysed with in situ hybridization using Dig-labelled HCMV immediate early antigen (MIE) and late antigen (LA) oligodeoxynucleotide probes at 24，72 h……1,2,3 and 4 weeks of postinfection, respectively.ResultsThe viral DNA was demonstrated within the nuclei of neurons during 4～5 th day of postinfection by in situ hybridization using MIE probe, but the viral DNA was seen in the nuclei and the cellular cytoplasm of the neurons during 7～28 th day using LA probe.ConclusionThe established methods shows considerable potential for diagnosis of HCMV infection and for pathogenicity researches.

MeSHdigoxigenin; in situ hybridization; cytomegalovirus; neurons; mouse

Free wordcerebral cortex

人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus, HCMV）是引起先天性中枢神经系统（CNS）感染的重要病原体之一。在胎儿、新生儿中，可致先天弱智、小头畸形等。HCMV还是器官移植失败和艾滋病患者并发感染致死的主要病因。我们借助于已建立的HCMV体外感染原代培养新生乳鼠大脑皮质神经元模型，采用地高辛（Digoxigenin, Dig）标记的HCMV DNA探针，建立了一种特异、敏感、简便的原位杂交法，为探讨该病毒感染大脑皮质神经元致病机理中的作用提供有用工具。

1材料和方法

1.1病毒HCMV AD169株由上海医科大学微生物学教研室提供，用人胚成纤维细胞（HF）培养增殖。使用前，将病毒在HF细胞上多次传代，以增加病毒毒力；按Gibson^〔1〕的CPE终点稀释法以在24～48 h内出现病毒致细胞变作用（CPE）达“～”的病毒悬液在HF细胞上滴定TCID₅₀；以6.0 log TCID₅₀/ml的病毒作为实验用毒种。

1.2细胞人成纤维细胞株（HF）及原代兔肾细胞均由本室自制。本研究采用的HF株为6～8代。

1.3主要试剂所用主要化学及分子生物学试剂分别购自Sigma公司、Promega公司和华美生物工程公司；地高辛DNA标记和检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。

1.4HCMV MIE和LA寡核苷酸探针序列合成与标记HCMV DNA MIE（即刻早期抗原）和LA（晚期抗原）寡核苷酸探针片段序列位置参考文献^〔2〕设计，MIE寡核苷酸探针序列：5′GAGGCTATTGTAGCCTACACTTTGG3′，序列位点为第900～925核苷酸；LA寡核苷酸探针片段序列为5′GTCGCCTGCACTGCCAGGTGCTTCG3′，序列位点第2 301～2 325核苷酸。DNA合成仪固相亚磷酸三酯法合成并纯化（中国科学院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室）。上述两种Digoxigenin标记的探针制备及检测按Boehringer Mannheim公司说明书进行。

1.5HCMV感染体外培养的新生乳鼠大脑皮质神经元模型的建立实验用Balb/c新生乳鼠由本校实验动物中心提供。原代培养物的制备基本参照吴希如等^〔3〕介绍的方法进行。将细胞接种至盛有已预先覆盖鼠尾胶原薄膜盖玻片的塑料培养皿内，最终细胞浓度1×10^9．L^-1。置37℃，5％ CO_２饱和湿度的CO_２培养箱内培养，48 h后，分别于相应孔内加入细胞分裂抑制剂5-氟-2脱氧尿苷15 mg^．L^-1和尿苷35 mg^．L^-1以抑制非神经元的过度增殖。再经48 h后，于每个试验孔内分别加入100 TCID₅₀病毒悬液0.1 ml，同时以相同病毒量感染HF细胞作为阳性对照。

观察和鉴定方法：每隔2～3天于倒置显微镜下观察、摄影记录、换液；并在病毒感染后的第24，48，72 h……和第1～4周分别连续取样，用于原位杂交检测等。

1.6原位杂交载有单层细胞培养物的盖玻片经4％多聚甲醛固定后，用0.2 mol^．L^-1 HCl作用20 min，Pronase K(20 mg^．L^-1)37℃作用10 min；再用含甘氨酸（2 g^．L^-1）PBS洗5 min×2，RNase A(100 mg^．L^-1)37℃作用30 min，经上述甘氨酸PBS洗涤后，再以40 g^．L^-1多聚甲醛后固定。再洗涤后，在细胞单层上滴加适量预热的杂交液，37℃作用30 min，用预热杂交液稀释DNA探针并置100℃变性5 min后速冷；倾去预杂交液，加入DNA探针（1～3 mg^．L^-1）；细心地盖上硅化盖玻片，边缘用石蜡油封闭后，置37℃杂交过夜。2×SSC、0.1％ SDS洗10 min×2，0.1×SSC、0.1％ SDS洗15 min×2后，按试剂盒说明书操作，进行免疫显色检测，出现颜色反应后，以TE终止反应。出现蓝紫色颗粒显色点为阳性杂交信号。常规脱水、透明、封固、照相记录。

每次实验均设如下对照：阴性对照①HSV-1感染的人成纤维细胞（HF）对照；②无标记探针的HCMV感染的新生乳鼠细胞培养物对照；③正常新生乳鼠脑神经细胞培养物对照。阳性对照：HCMV感染HF细胞培养物。

2结果

2.1新生乳鼠大脑皮质神经元原代培养物形态观察在倒置显微镜下，于鼠尾胶原片上培养48 h内的多数细胞呈小圆簇附于薄膜上，并有小突起细胞簇向外伸出。培养96 h以后，扁平多角形细胞开始形成，增多。两周后，形成神经胶质细胞层，具有各种长度和厚度的突起的神经元分散在胶质层上，突出的网络更加密集，与远处细胞相互接触。培养至3～4周时，未见明显细胞退变现象（图1A）。

图1HCMV感染后2周新生乳鼠脑神经元的光镜观察

A正常神经元（↑，×200）；BHCMV感染的神经元（×200）

HCMV感染的神经元在培养第1周时可见到少数胶质细胞出现变圆肿胀，神经元形态明显改变发生在培养的第2周以后，镜下观察时可见神经元胞核肿胀，胞浆颗粒增多，折光性减弱，突起断裂。随着时间的延长，细胞裂解液化（图1B）。

2.2原位杂交最适条件探索

2.2.1消化液中蛋白酶K浓度的选择经选用含10，20，50和100 mg^．L^-1四种不同浓度蛋白酶K的消化液作用于原代培养的HCMV感染的细胞单层后，进行原位杂交的结果发现，蛋白酶K浓度在10 mg^．L^-1时无杂交信号出现；而当蛋白酶K浓度大于100 mg^．L^-1时，细胞结构明显受损，出现破碎脱落现象，不利于结合细胞形态观察。蛋白酶K浓度以取20～50 mg^．L^-