摘要目的探讨丙型病毒性肝炎（丙肝）患者外周血单个核细胞（PBMC）HCV-RNA(+)后对其细胞免疫功能的影响及其在丙肝发病机制中的作用。方法以RT-PCR法检测135例丙肝患者PBMC内HCV-RNA，同时用生物素—链霉亲和素（BSA）系统检测其T细胞亚群及经PHA诱导前后膜白介素-2受体（mIL-2R）的表达水平。结果丙肝患者与正常对照相比，CD⁺₃、CD⁺₄及mIL-2R表达水平降低，CD⁺₈水平增高，差异均有显著性(P＜0.01) 。PBMC内HCV-RNA（+）组与HCV-RNA（-）组相比较，前者CD⁺₃、CD⁺₄ 百分率降低，CD⁺₈百分率增高，CD⁺₄/CD⁺₈比值下降均大于后者，差异有显著性(P＜0.05)。PHA诱导前后HCV-RNA (+)者明显低于HCV-RNA(-)者，mIL-2R表达水平亦以患者低于正常对照（P＜0.05）。结论丙肝患者细胞免疫功能低下，病毒侵染PBMC后可加重患者的细胞免疫功能紊乱，抑制mIL-2R表达，使病情迁延反复。检测丙肝患者PBMC内HCV-RNA对揭示丙肝发病机制及其防治均有重要意义。

中国图书资料分类法分类号R512.63

The influence of PBMC infected by HCV on the

function of cellular immunity

Wang Jian, Zhang Rongbo, Xu Lifa et al

(Dept of Etiology and Immunology, Medical College of Huainan

Industry University, HuainanAnhui232001)

AbstractObjectiveTo study the function of cellular immunity after being infected by HCV in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in patients with hepatitis C and effect on pathogenesis of hepatitis C.Methods HCV-RNA was detected by reverse transcription nested polymerase chain reaction(RT-PCR) from PBMC in 135 cases of hepatitis C, and the expressive level of T cell subsets and membrane interleukin-2 receptor(mIL-2R) before or after PHA inducement were detected by biotin-streptavidin(BSA) system.Results The levels of CD₃, CD₄ and mIR-2R were all lower and CD₈ was higher in patients with hepatitis C than in normal control (P＜0.01). It was lower in positive HCV-RNA than in non-positive HCV-RNA in PBMC. The levels of mIL-2R before and after PHA inducement were both significantly lower in patients with hepatitis C than those in normal control(P＜0.05）. It was significantly lower in positive HCV-RNA than that in nonpositive HCV-RNA.Conclusion The function of cellular immunity was lower obviously in patients with hepatitis C. Infection of HCV in PBMC could cause the disorder of cellular immunity function, and restrained the expression of mIL-2R and made the patient's condition deferment or relapse.Detection of HCV-RNA in PBMC in patients with hepatitis C could help us explain the pathogenesis of hepatitis C,which showed significance for the prevention and treatment of Hepatitis C.

MeCH hepatitis C／immunol;monocyted;T-lymphocyte subsets;receptors,interleukin-2;immunity,cellular;polymerase chain reaction.

丙型病毒性肝炎（丙肝）是一种严重危害人类身心健康的传染性疾病，其发病机制十分复杂。以往文献^〔1〕表明，丙肝的发病主要与患者的细胞免疫功能有关。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)为免疫活性细胞的集合体，富含T淋巴细胞，其在机体抗HCV感染中起极为重要的作用。本研究用RT-PCR法检测丙肝患者PBMC内HCV-RNA，同时用生物素—链霉亲和素(Biotin-streptavidin，BSA)系统测定其CD⁺₃、CD⁺₄、CD⁺₈ 百分率及PHA诱导前后膜白介素-2受体（membrane interleukin-2 receptor, mIL-2R）表达水平，以评价HCV侵染PBMC后对细胞免疫功能的影响，探讨其在丙肝发病机制中的作用。

1材料与方法

1.1研究对象135例丙肝患者系本院门诊部及附属医院、教学医院1995年1月～1998年7月治疗的患者，并经ELISA法筛选抗-HCV（+）。患者中急性丙肝31例，慢性丙肝104例，临床诊断参照1990年全国第6届肝炎会议修订的诊断标准。其中男88例，女47例，平均年龄34.5岁。另选取中心血站20名体检正常献血员为正常对照，其中男14例，女6例，平均年龄30岁。

1.2试剂HCV-RNA诊断试剂盒购自上海华美生物工程公司，批号950210。T细胞亚群及mIL-2R诊断试剂盒购自上海思创生化电子有限公司。淋巴细胞分离液购自上海生化试剂二厂，批号：941026。1640培养粉为USA产品。

1.3方法T细胞亚群及mIL-2R检测参照朱睛晖、王健等方法^〔2，3〕。PBMC内HCV-RNA检测以淋巴细胞分离液常规分离出PBMC，用灭菌Hank液洗涤3次，调整细胞数至1×10^9.L^-1, 取100 μl细胞悬液加等量裂解液，混匀后置37℃温箱中裂解20 min后镜检， 细胞裂解充分后参照常规血清HCV-RNA方法进行检测，另以20名正常献血员PBMC悬液同法裂解，做HCV-RNA检测，探讨是否存在由于裂解液对细胞自身DNA作用所致的假阳性，每次检测设空白、阴性、阳性对照各1孔。引物选自HCV-RNA基因组5′编码区（5′-NC），最终扩增片段长度为194 bp 。第1次PCR扩增在逆转录酶作用下进行cDNA合成，扩增条件为94℃预处理4 min，以后依次为94℃ 40 s、55℃ 40 s 、72℃ 1 min , 循环30次，将cDNA产物立即进行第2次PCR，扩增条件为94℃预处理4 min，以后依次为94℃ 50 s、55℃ 40 s、72℃ 90 s ，循环35次。扩增产物经含2% EB的琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪下观察结果，出现与阳性对照一致者判为阳性。

2结果

经RT-PCR对135例丙肝患者PBMC检测，发现有56例HCV-RNA（+），说明HCV易侵犯患者PBMC。T细胞是一种多功能的细胞群体，当HCV侵染时，受染的各T细胞亚群出现不同形式改变（见表1），并可影响PHA对其mIL-2R的诱导反应（见表2）。

表1丙肝患者T细胞亚群检测结果(±s, %)

类型 n CD⁺₃ CD⁺₄ CD⁺₈ CD⁺₄/CD⁺₈ 正常对照

20

66.85±7.20

48.35±6.56

30.45±4.88

1.61±0.42 丙肝 135 61.21±8.46^** 40.88±7.07^** 35.14±6.32^** 1.19±0.55^** PBMC内HCV-RNA(+) 56 58.73±8.75^**△ 39.28±6.84^**△ 36.33±5.67^**△ 1.06±0.59^**△ PBMC内HCV-RNA(-) 79 62.20±8.36^** 42.03±7.25^** 33.92±6.89^* 1.28±0.53^**

与正常对照相比：^*P＜0.05, ^**P＜0.01；

PBMC内HCV-RNA(+)与PBMC内HCV-RNA(-)相比：^△P＜0.05

表2PBMC经PHA诱导前后mIL-2R 表达水平（±s,%）

类型 n

mIL-2R 静息期 诱导期 正常对照

20

4.36±1.50

36.72±3.10 丙肝 135 3.22±1.89^* 33.62±3.85^* PBMC内HCV-RNA(+) 56 2.84±1.94^** 32.06±3.94^** PBMC内HCV-RNA(-) 79 3.58±1.87^△ 34.15±3.78^△

与正常对照相比：^*P＜0.05, ^**P＜0.01；