中国骨伤2000年第13卷第2期

胡光亮杜靖远王洪谢晶

摘要：目的探讨补肾密骨液影响骨代谢的作用机制。方法利用组织培养技术，将不同浓度的补肾密骨液与分离培养制得的新生大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞共同培养，用MTT比色分析法和³H-TdR掺入法观察补肾密骨液对成骨细胞样细胞增殖的影响，用原子吸收分光光度法观察补肾密骨液对颅盖骨吸收的影响，并与鲑鱼降钙素进行对照。结果补肾密骨液以剂量依赖的方式促进成骨细胞样细胞的增殖，并抑制颅盖骨的吸收；而鲑鱼降钙素对成骨细胞样细胞的增殖无影响，但对颅盖骨的吸收有明显的抑制作用。结论补肾密骨液直接参与骨代谢的调节，促进骨形成，同时抑制骨吸收。

关键词：中草药药理学成骨细胞

临床观察^［1］和动物实验^［2］证实补肾密骨液对骨质疏松症有良好的防治作用，但这些研究均是在体内进行的，影响因素较多，难以明确补肾密骨液影响骨代谢的作用方式。为此我们采用实验条件更加单一的组织培养技术，观察了补肾密骨液对成骨细胞样细胞增殖和骨块吸收的影响。

1材料与方法

1.1补肾密骨液的制备补肾密骨液由淫羊藿、杜仲、胡桃肉、干地黄、天花粉、淮牛膝各10g组成，经水煎醇沉制成相当于生药2g／ml的药液，调pH值至7.0，用1％活性炭脱色3次，精滤，分装，高压蒸气灭菌，密封备用。制得的药液符合中国药典注射剂的规定。

1.2成骨细胞样细胞的分离、培养将新生的SD大鼠（由同济医科大学实验动物中心提供）放入75％酒精中浸泡消毒15分钟，无菌操作下取出颅盖骨，除去附着的血管及结缔组织，用平衡盐溶液清洗3次，剪碎。洗净的碎骨块用少量410u／ml的Ⅱ型胶原酶（Sigma）预消化15分钟，吸掉消化液，再用平衡盐溶液清洗干净后，加入5倍于骨块体积的前述胶原酶，于37℃水浴中振荡下消化1.5小时。120目尼龙网过滤后，滤液经1000转／分离心5分钟，弃上清液，所得白色沉淀物即为制得的成骨细胞样细胞团。加入含10％胎牛血清、青霉素100u／ml、链霉素100μg／ml的RPMI1640培养液，稀释成2×10⁵／ml的细胞悬液，装入无菌培养瓶内，置入37℃，含5％CO₂的培养箱内进行培养，每3天更换1次培养液。待细胞会和后用0.25％胰蛋白酶消化传代，取第Ⅱ继代的成骨细胞样细胞供实验应用。

1.3补肾密骨液对成骨细胞样细胞增殖的影响第Ⅱ继代成骨细胞样细胞用培养液稀释成2×10⁵／ml的细胞悬液，以每孔100μl孔加入96孔培养板内，放入CO₂培养箱内孵育24小时，以6孔为一平行样本，分别加入不同浓度的补肾密骨液或鲑鱼降钙素（Sandoz）20μl，同时每孔再加入培养液80μl，空白对照组只加入100μl培养液。这样每孔的培养体积达200μl。补肾密骨液的作用浓度分别为相当于生药10μg／ml、100μg／ml、1000μg／ml、5000μg／ml；鲑鱼降钙素的作用浓度分别是10μg／ml、50μg／ml、100mu／ml。上述物质加完后，继续培养72小时，用溴化二甲基噻唑联苯四唑（3-（4，5-dimethylthiazol）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）比色分析法或³H-胸腺嘧啶核苷（³H-TdR）掺入法检测细胞增殖情况。

1.4补肾密骨液对体外培养骨块吸收的影响在无菌操作下取出5天龄SD大鼠的颅盖骨（左右两块不从中缝剪开，去除附着的神经组织，保留完整的骨膜），置于24孔培养板内的自制铜网支架上，使骨块刚好与培养液相平。所用培养液为含10％胎牛血清、1mM磷酸盐的PRMI1640培养液，每孔用量为1ml。将24孔培养板置37℃、5％CO₂培养箱内预培养24小时，将骨块从中缝剪开，转移至盛有新鲜培养液的相同培养板内，进行配对分组实验，其中一块放于含观察组药物的培养液中，另一块放于含对照组药物的培养液中，具体分组情况见表1。作用72小时后，分别收集每孔内的培养液，经去离子水稀释后于WFX-IF₂原子吸收分光光度计上测量培养液中钙离子的含量。培养骨块于50％甲酸溶液1ml内溶解后，用同样的方法测出骨块中剩余钙离子的量，并用下列公式计算出钙离子释放百分率：钙离子释放百分率＝培养液中钙离子含量÷（骨块中剩余钙离子含量＋培养液中钙离子含量）×100％。钙离子释放百分率的大小反映骨块吸收程度。

表1颅盖骨骨吸收配对实验分组及各组所用药物

实验 观察组 对照组 每组例数 骨吸收模型实验 甲状旁腺激素（PTH）

（10ng／ml） 培养液 6 补肾密骨液抑制骨吸收实验 补肾密骨液（1000μg／ml）＋PTH（10ng／ml） PTH（10ng／ml） 6 降钙素抑制骨吸收实验 鲑鱼降钙素（10mU／ml）＋PTH（10ng／ml） PTH（10ng／ml） 6

2结果2.1补肾密骨液对成骨细胞样细胞增殖的影响

2.1.1MTT比色分析法结果：如表2所示，补肾密骨液组OD（吸光度）值随着浓度的增加而增大，与对照组10μg／ml组比较，差异即有显著性意义（P＜0.05），与100μg／ml组比较，P＜0.01，与1000μg／ml组比较，P＜0.001。不同浓度的鲑鱼降钙素组OD值变化不大，与对照组相比较，差异无显著性意义（P＞0.05）。

表2成骨细胞样细胞增殖的MTT比色分析法结果

分组 样本数（n） OD值（X±SX） 对照组 6 0.2075±0.0026 10μg生药／ml补肾密骨液组 6 0.2178±0.0032^* 100μg生药／ml补肾密骨液组 6 0.2258±0.0040^** 1000μg生药／ml补肾密骨液组 6 0.2341±0.0037^*** 5000μg生药／ml补肾密骨液组 6 0.2328±0.0031^*** 10mU／ml鲑鱼降钙素组 6 0.2090±0.0035^△ 50mU／ml鲑鱼降钙素组 6 0.2100±0.0029^△ 100mU／ml鲑鱼降钙素组 6 0.2120±0.0034^△

注与对照组相比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，△P＞0.05（表3、4同此）

表3成骨细胞样细胞增殖的³H-TdR掺入法结果

分组 样本例数（n） CPM值（X±SX） 对照组 6 377.5±32.3 10μg生药／ml补肾密骨液组 6 546.7±57.7^* 100μg生药／ml补肾密骨液组 6 790.5±89.7^** 1000μg生药／ml补肾密骨液组 6 1050.8±76.1** 5000μg生药／ml补肾密骨液组 6 1100.5±102.0^** 10mU／ml鲑鱼降钙素组 6 385.2±29.8^△ 50mU／ml鲑鱼降钙素组 6 355.8±36.3^△ 100mU／ml鲑鱼降钙素组 6 392.0±37.5^△

表4各组骨块钙离子释放百分率（％）

分组 每组例数 观察组 对照组 骨吸收模型实验 6 17.6±0.5^ 8.1±0.3 补肾密骨液抑制骨吸收实验 6 14.8±0.4 17.3±0.4 鲑鱼降钙素抑制骨吸收实验 6 13.9±0.3^ 17.4±0.5

2.1.2³H-TdR掺入法结果：如表3所示，CPM（放射性每分钟计数）值变化规律与OD值变化规律完全吻合。

上述实验结果表明：补肾密骨液以剂量依赖的方式促进成骨细胞样细胞的增殖，而鲑鱼降钙素对细胞增殖无影响。

2.2补肾密骨液对骨块吸收的影响

如表4所示，10ng／ml的甲状旁腺激素使培养骨块钙离子释放百分率由8.1％±0.3％升高到17.6％±0.5％（P＜0.01），提示甲状旁腺激素促进体外培养骨块的吸收，骨吸收模型成立。补肾密骨液与鲑鱼降钙素均能明显地抑制甲状旁腺激素引起的骨块钙离子释放百分率的增加（P＜0.05及P＜0.01），表明补肾密骨液与鲑鱼降钙素均能抑制体外培养骨块的吸收。

3讨论

本研究结果表明：补肾密骨液不仅能促进体外培养成骨细胞样细胞的增殖，而且还抑制体外培养骨块的吸收，而治疗骨质疏松症的常用药物鲑鱼降钙素仅对体外培养骨块的吸收有抑制作用，对成骨细胞样细胞的增殖无影响<