【关键词】 肝炎病毒，乙型；基因；突变；核苷（酸）类似物 Mutation incidence of and resistant sites in HBV after long-term nucleoside analogs therapy LIANG Xue-song,WAN Mo-bin 【Key words】 Hepatitis B virus;Genes;Mutation;Nucleo-side analogs 【First author’s address】 Department of Infectious Diseases,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shang-hai 200433,China Corresponding author:WAN Mo-bin,Email:mobinwan@yahoo.com.cn 目前批准的核苷（酸）类似物如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等可抑制HBV复制。然而，HBV闭合环状DNA（cccDNA）存在于感染细胞核中，需要延长治疗时间以达到防止停药后病毒复制反弹。伴随治疗时间延长出现的问题就是发生选择性抗病毒药物耐药突变。随着核苷（酸）类抗病毒药物的应用，抗病毒药物耐药突变已经成为目前临床医师进行CHB治疗面临的主要问题，由于不同核苷（酸）类似物抗病毒耐药变异位点和变异发生率不同，为了便于临床监测和选择药物，因此我们有必要了解不同核苷（酸）类似物耐药位点及其变异发生率。

一、核苷（酸）类似物的突变位点及敏感性变化 核苷（酸）类似物特异性地与HBV聚合酶的某一部位结合，影响病毒复制。但也可能由于HBV聚合酶区基因突变，导致某些特定部位的氨基酸被置换，使之与药物的结合力下降，出现药物敏感性降低和耐药。所有耐药基因突变位点都位于逆转录酶区，目前已经统一耐药基因突变位点的定位命名，即从逆转录酶区的上游第1个氨基酸起，分别为rt1—rt344。其中又再分为A、B、C、D、E、F、G等亚区。目前已知常见的耐药突变位点主要见于逆转录酶区的A、B、C、D区。

拉米夫定是第一个被批准治疗CHB患者的核苷（酸）类似物，并被广泛应用。因此有关拉米夫定耐药变异研究也最多，拉米夫定变异位点主要存在于HBV聚合酶C区YMDD基因序列，最常见的突变位点是M204氨基酸置换或联合L180氨基酸置换。另外Delaney等报道V173是第3个拉米夫定耐药变异位点，该变异位点只在L180M+M204V/I/S变异HBV感染者中发生；体外研究显示，rtV173L位点变异可恢复rtL180M+rtM204V变异HBV的复制效率，且保留了病毒对拉米夫定的耐药性，但是rtV173L+rtL180M+rtM204V变异株在体外仍然保持了对阿德福韦的敏感性。

阿德福韦对HBV病毒也有很好的抑制作用，79%HBeAg阴性HBV感染者在治疗144周时HBV DNA<10³拷贝/ml。HBV逆转录酶保守区N236T氨基酸置换是阿德福韦标志性耐药变异位点。此外，位于HBV逆转录酶D区，靠近拉米夫定YMDD耐药变异位点的A181V氨基酸置换也是阿德福韦耐药的重要位点。 恩替卡韦是最近才批准的治疗CHB的核苷（酸）类似物，因此有关恩替卡韦耐药的资料较少。恩替卡韦耐药位点是在拉米夫定耐药位点基础上另加逆转录酶B区T184G、S202G/I和（或）D区M250V。所有这些变异均同拉米夫定具有交叉耐药，但体外研究显示这些病毒株对阿德福韦仍敏感。

此外，其它正在进行Ⅲ期或Ⅱ期临床研究的核苷（酸）类似物治疗HBV也有其特异变异位点，如近期的Ⅲ期临床研究结果显示，恩曲塞他平变异位点也主要在YMDD基因序列，基本同拉米夫定突变位点；替比夫定变异位点为M204V/I/S，而替诺福韦变异位点为A194M。此外，Pradefovir和阿德福韦具有相同的突变位点，而克拉夫定（clevudine）和拉米夫定具有交叉耐药位点。

体外实验证实，发生基因突变的病毒对药物的敏感性下降。例如，M204V、M204I、M204V/I联合L180M的HBV突变株在体外对拉米夫定的EC50分别提高153、550、3010倍；N236T的HBV突变株对阿德福韦的敏感性下降6—14倍。不同HBV病毒株对恩替卡韦的体外药物敏感实验证实，野生株和大多数单纯恩替卡韦相关突变株（I169、T184、S202）的敏感性相似，但M250V突变株的敏感性下降8.7倍。拉米夫定耐药突变株（L180+M204）的敏感性下降7.6倍，而拉米夫定耐药突变联合恩替卡韦相关突变的病毒株对恩替卡韦的敏感性明显下降，可达11—761倍。因此，试图通过提高药物剂量来恢复HBV突变株的敏感性是不可行的。体外表型实验结果还提示，发生基因突变病毒对核苷（酸）类似物的敏感性都有一定程度下降，但是某种药物相关的突变株对另一种药物可能仍然保持一定的敏感性。体外交叉耐药研究结果提示，拉米夫定耐药病毒株（M204V+L180M）对恩替卡韦、恩曲赛他平、替比夫定、克拉夫定的敏感性下降，但仍然保持对阿德福韦和替诺福韦的敏感性；阿德福韦耐药株（N236T）对克拉夫定和替诺福韦的敏感性下降，但仍然保持对拉米夫定、恩曲赛他平、恩替卡韦、替比夫定的敏感性；但阿德福韦耐药株（A181V）对拉米夫定、恩替卡韦的敏感性下降，但仍然保持对替诺福韦的敏感性。这些研究结果都是临床上对耐药患者改变药物治疗的理论和试验根据。

二、不同核苷（酸）类似物耐药发生率 接受核苷（酸）类似物治疗的患者病毒变异发生率与治疗前病毒水平、药物抑制病毒复制能力和治疗时间相关。此外，病毒变异率也同基因检测技术敏感性相关。

1．拉米夫定耐药变异发生率：拉米夫定耐药变异发生率随着用药时间的延长而升高，治疗1年患者rtM204V/I变异发生率达15%—30%，而治疗4—5年变异发生率可高达70%。在HIV与HBV重叠感染者中拉米夫定耐药基因型突变在治疗4年时可达90%。这种变异发生率同HBV DNA抑制强度有关，Yuen等报道治疗24周时血清HBV DNA水平下降到2×10²—1×10³拷贝/ml时耐药变异发生率为13%，HBV DNA水平为1×10³—1×10⁴拷贝/ml时变异发生率为32%，那些在治疗24周时病毒载量仍高于10⁴拷贝/ml者耐药变异发生率高达64%。Liaw等在一项包含358例HBeAg阳性CHB患者的双盲对照研究中发现，在连续用药3年的患者中发生YMDD突变的情况为：1年发生率15%，2年38%，3年53%。Liaw等进行的另一项临床研究有651例HBeAg阳性（阴性）且有明显肝纤维化或肝硬化的CHB患者，接受拉米夫定100mg/d治疗32个月，YMDD突变发生率为49%，所有变异病例均伴有Child-Pugh评分上升。

2．其他上市核苷（酸）类似物耐药变异发生率：同拉米夫定相比，阿德福韦耐药基因突变发生率较低，应用直接基因测序法对2个Ⅲ期临床研究病例在治疗48周时检测显示，没有基因型突变发生。70例HBeAg阴性患者接受阿德福韦治疗5年资料显示，病毒耐药突变随着治疗时间延长而升高，治疗1、2、3、4、5年的变异率分别为0，3%，11%，18%，29%。阿德福韦治疗拉米夫定耐药病例发生耐药突变概率上升，最近有研究报道阿德福韦治疗包含拉米夫定耐药病例在内的CHB患者1年耐药发生率为5%，2年为20%。但是阿德福韦联合拉米夫定治疗变异发生率较低，联合治疗拉米夫定治疗失败病例3年的变异发生率仅为2%。另外，在阿德福韦联合拉米夫定或恩替卡韦初始治疗病例中也未见阿德福韦耐药变异发生。总之，在阿德福韦治疗前2年内耐药变异发生率低，且阿德福韦变异可通过联合治疗延迟或不发生。

恩替卡韦是最近才批准用于治疗HBV感染的核苷（酸）类似物，因此有关其抗病毒耐药变异发生率的资料有限。目前的资料仅限于3年变异率报道。恩替卡韦初始治疗3年时无基因耐药变异发生，而拉米夫定治疗失败病例，1年基因反弹的临床耐药率分别为：1年1%，2年10%，3年25%。

3．在研核苷（酸）类似物耐药变异发生率：Lai等报道为期2年的替比夫定和拉米夫定双盲对照研究结果显示，在HBeAg阳性病例基因耐药发生率为21.6%，其中伴有病毒反弹的临床耐药率为17.8%；HBeAg阴性病例基因耐药发生率为8.6%，临床耐药率为7.3%。

有关恩曲塞他平的Ⅲ期随机双盲对照临床研究结果显示，64例恩曲塞他平治疗结束时30%（19/64）发生YMDD变异；治疗48周时，耐药变异发生率为12.6%，与拉米夫定有相似的耐药发生率，这提示该药作为单药治疗会受到限制，但目前的研究显示该药在联合治疗方面具有一定价值。 有关克拉夫定、Pradefovir和替诺福韦等药物治疗CHB的相关耐药突变发生率还有待进一步临床研究资料报道。