随着新的核苷类似物阿的福韦酯和恩替卡韦用于临床及治疗方案的不断优化，核苷类似物对慢性乙型肝炎的疗效已得到肯定。对于一名肝病专科医生来说，选用核苷类似物长期抗乙肝病毒治疗，面临的最重要问题之一是治疗过程中乙型肝炎病毒的(HBV)耐药性问题。目前所有口服核苷类似物（包括拉米夫定，阿德福韦，恩替卡韦和替比夫定）治疗过程中均可出现耐药性。然而，对耐药相关的一些问题国内外均没有共识。比如：（1）现阶段不同核苷类似物耐药相关的概念和定义不一，导致比较不同核苷类似物临床和病毒耐药无统一的标准。（2）我们能否在开始核苷类药物治疗前和治疗一段时间（6个月或1年时）评估病人出现耐药的可能性和风险, 预测耐药性的产生时间？（3）临床上如何确定在什么时机检测耐药？用什么方法检测耐药性？（4）一旦出现耐药，在什么时机（基因型耐药或者表型耐药）加用（add-on）或改用(Switch)其它药物治疗, 用什么药？HBV耐药这一课题涉及从基础分子病毒学和药理学到临床病人管理等一系列相关的问题，已成为乙型肝炎抗病毒治疗的中心议题之一。

一、HBV核苷类似物耐药的几个相关概念

1．基因型耐药（Genotypic resistance） 指乙肝病毒基因（通常位于P基因）出现某种特定的突变，这些突变点已通过体内外实验证实与耐药密切相关。

2．病毒耐药 （Virological resistance） 出现某种特定的关键耐药突变，同时有病毒定量反跳大于一个log10, 或治疗中HBV DNA从无下降到4 log10拷贝/毫升以下。

3．表型耐药（Phenotypic resistance）和临床耐药（Clinical resistance） 表型耐药有二种不同的含义，药理学或病毒学定义指在体外药敏检测系统中，病毒毒株对药物的敏感性明显下降，通过用IC50来表示，可通过细胞培养系统、动物模型等方法来检测。表型耐药的另一种含义，即指临床耐药，出现某种特定的关键耐药突变，同时有病毒耐药和ALT反跳。

4．抗病毒治疗应答 在讨论临床耐药时，先要明确何谓抗病毒治疗应答，目前对此并无明确界定。Locarnini等认为，抗病毒治疗应答应是治疗开始的3个月之内病毒较基线水平下降至少1 Log10IU/ml。临床耐药包括以下情况：

（1）治疗初始失效 如果3个月的抗病毒治疗病毒水平未下降1 Log10IU/ml，可以认为是抗病毒治疗无效。

（2）治疗过程中失效 治疗开始时产生应答，但在治疗过程中HBV DNA较最低点反弹上升超过1 Log10IU/ml，且间隔1个月检测2次均证实为上述结果, 可有或无ALT水平升高和相关症状。

以上2种情况均提示广义的临床耐药，但诊断临床耐药需要排除其他可能引起病毒上升的原因，包括依从性问题、药物吸收问题。发现临床耐药后应通过基因型耐药和表型耐药测定来确定结果。

5．已经确定的HBV核苷类似物耐药耐药毒株的变异类型及交叉耐药

根据体外试验结果将耐药程度分为轻、中和高度。比如YMDD区域的rtM204V/I 对LAM高度耐药，而rtL180M突变对LAM中度耐药，rtL180M突变往往在M204 V/I/S突变的基础上出现。这二种突变对恩替卡韦轻度耐药。

交叉耐药可通过体外或体内试验确定，体外耐药指某一药物产生50%药物抑制病毒复制浓度， 交叉耐药程度分为轻、中和高度LDT病毒学突发的病例主要由于rtM204V/I耐药所致，在未使用核苷类似物患者治疗52周时耐药率为 4.5%。对阿的福韦产生耐药的变异株包括N236T和A181V，体外实验表明，所有的拉米夫定耐药毒株对阿的福韦均敏感，而阿的福韦耐药毒株对拉米夫定也是敏感的。两者不存在交叉耐药。

恩替卡韦的耐药发生在拉米定耐药的基础上，变异位点除了YMDD变异外，还有A184G、S202I和M250V等位点的变异。尽管恩替卡韦对拉米夫定耐药毒株的敏感性明显下降，但通过加大剂量临床上仍然可有效抑制拉米夫定耐药毒株的复制。利用可以稳定表达HBV野生株和拉米夫定耐药变异株（包括四种变异模式：L180M+M204V，V173L+L180M+M204V，M204I和L180M+M204I）的五种细胞系进行体外实验表明，恩替卡韦对拉米夫定耐药变异株的敏感性均低于野生株，下降程度在不同细胞系各不相同：恩替卡韦对M204I变异病毒株的敏感性下降最明显（471倍），对其他变异病毒株的敏感性下降程度在37至164倍间。因此，恩替卡韦对拉米夫定耐药变异株的抗病毒活性降低，对不同变异病毒株的抗病毒活性降低程度不同。 二、能否在治疗开始和治疗中预测耐药性的产生？

开始核苷类药物治疗前和治疗中，我们要评估病人出现耐药的可能性和风险, 预测耐药性的产生。 最近陆续有报道认为一些因素可作为预测YMDD变异产生的指标。例如国外的研究发现治疗前ALT超过3倍正常值、HBeAg阳性、HBV DNA水平高于1495Meq/ml以及接受过泛昔洛韦治疗的病人容易发生耐药。我们对247例接受拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者进行随访后发现，治疗前HBeAg阳性和HBV DNA超过7.5×106 拷贝/ml者发生YMDD变异的可能性较高，治疗前HBeAg阳性的患者发生YMDD变异出现早。

接受拉米夫定治疗的病人治疗6个月时HBV DNA水平对于出现耐药性的评估具有重要价值。在香港进行的一项研究，对159例拉米夫定治疗患者进行随访研究，平均随访时间30个月，发现如果患者接受拉米夫定治疗6个月时HBV DNA水平仍高于103拷贝/ml，随访结束时发生YMDD变异的可能性为62.3%，而治疗6个月时HBV DNA水平低于103拷贝/ml者，随访结束时发生YMDD变异的可能性仅为13%。可见治疗前和治疗过程中通过一些临床指标的监测可预测YMDD变异的产生。

Locarnini报告ADV治疗一年时HBV DNA水平可以预测3年时ADV耐药发生的情况，一年时70%病人HBV DNA水平小于3 log，30% 患者病毒载量 大于1000copies/mL。治疗144周一年时70%病人HBV DNA水平小于3 log 者4例（5%）发生耐药，HBV DNA水平大于3 log者中34例（30%）病人发生 ADV耐药。

三、如何确定在什么时机检测耐药？

我们目前无法在治疗前确定病人在什么时候出现对某一核苷类似物的耐药性，因此在治疗过程中选择适当的时机检测耐药非常重要。任何认为不需要检测耐药或等出现临床耐药再检测耐药都是不妥当的。最近的研究表明等病人出现临床耐药再改用其它药物治疗可能为时已晚。 初治病人一旦开始用核苷类似物治疗，要根据不同的核苷类似物确定耐药检测的时机或时间点。对于拉米夫定治疗的病例，检测点确定在5个月，9个月，12个月，以后每2-3个月检测。ADV由于出现耐药较晚，治疗1年，2年以后每3个月检测较为经济合理。

对于已用过核苷类似物治疗的复治病人要根据具体情况确定个体化检测耐药的时间点。原为耐药或治疗失败的病例不要再用同样的核苷类似物药物或有交叉耐药的核苷类似物治疗；治疗停药复发的病例，必须检测基线耐药情况，这对治疗的选择相当重要，如基线已有耐药不要在选用同样的或有交叉耐药的核苷类似物治疗。对于原有YMDD耐药的病例如选用ETV治疗，治疗6个月后应每2-3个月检测耐药。

四、用什么方法检测耐药性？

建立精确、简单和经济的方法对于慢性HBV感染抗病毒治疗中耐药性的确定和监测具有重要的意义。目前使用的方法主要包括直接测序、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、序列特异性PCR和线性探针杂交技术，目前对各种方法的准确度作对比与评价的报道不多。其中基因序列测定是最直接的方法，但过程复杂，成本高。序列特异性PCR 特异性不够，临床已基本不用。

PCR-RFLP方法是一种简明和较为完善的方法，以错配PCR结合限制性片段长度多态性方法,快速检测患者体内YMDD变异株的发生情况，该方法通过错配PCR引入独特的酶切位点，再用酶切分析，图谱简单，容易判断。此方法具有较好的可靠性和可行性。由于酶切方法只能检测单点突变 ,对于可能伴随其它变异需经过测序分析, 因此实际应用中应结合PCR-RFLP筛检和PCR产物克隆后测序互相证实和补充。

线性探针杂交技术除了能够对HBV进行基因分型外，该法还能对拉米夫定和阿德福韦几种重要的耐药突变进行检测。本方法准确率较高。同时能检测出野株和变异株混合感染，且较直接测序更为敏感。目前看来，线性探针杂交法为一种快速、较为准确而且适合临床常规检测耐药的技术，缺点是价格昂贵。

五、病毒出现耐药如何处理？在什么时机加药或换药？换什么药？

由于新的药物的临床应用，对拉米夫定耐药病人的处理，已有了长足的进步。一方面因为可供选择的药物种类在不断增加，我们可以选用阿的福韦、恩替卡韦来或α干扰素/长效干扰素治疗。同时临床医生对耐药的认识也在不断深化。 最近二种新认识对临床医生很重要，一种认为认为在LAM基因型耐药加用或改用其它药物比等出现表型耐药对治疗预后好，另一观点认为LAM耐药后如加用阿德福韦酯联合治疗好。

阿的福韦上市后，很大程度上改变了过去对拉米夫定耐药的处理模式。有关阿德福韦酯治疗拉米夫定耐药病人的报道已较多。本文不再列举。最近有研究比较了阿德福韦治疗对拉米夫定基因型和表型耐药的HBeAg阴性慢性乙型肝炎病人的结果，对阿德福韦的应用时机（基因型耐药或者表型耐药）对治疗预后的影响进行分析。46例表型耐药（A组，HBV DNA>6 log10 拷贝/毫升，谷丙转氨酶升高）的HBeAg阴性病人以及28例发生基因型耐药（B组，HBV DNA 3～6log10 拷贝/毫升，A