摘要目的：探讨非小细胞肺癌神经内分泌分化的免疫组化诊断。方法：选择三种神经内分泌共同标记CGA、SYN、NCNM，应用免疫组化LSAB法，观察它们在NSCLC中的表达。结果：在163例NSCLC中，18例(11.04％)表达CGA，63例(38.65％)表达SYN，40例(24.54％)表达NCAM。77例(47.24％)NSCLC至少有1种NE标记表达，其中40例只表达1种标记，30例表达2种标记，仅7例3种标记均表达。3种标记表达彼此相关(P<0.005)，但存在差异(P<0.005)。与腺癌相比，腺鳞癌、鳞癌、大细胞癌染色阳性率较低。结论：选择3种NE标记可以检测出NSCLC的NE分化，但不能以某一种标记的表达与否作为NSCLC的NE分化诊断，应联合检测以至少2种标记表达定义为NE分化，在不同类型的NSCLC中腺癌更易出现NE分化。

关键词：非小细胞肺癌神经内分泌分化免疫组织化学神经细胞粘附分子突触素嗜铬蛋白A
越来越多的研究显示非小细胞肺癌(NSCLC)存在明显的异质性，出现与小细胞肺癌(SCLC)、类癌(TC)相似的神经内分泌(neuroendocrineNE)分化,通过电镜观察胞浆内出现特异性致密核心颗粒(DCG)，但其在日常的病理诊断中受到一定限制。本研究应用免疫组化LSAB法选择3种当前认为特异性和敏感性较好的NE标记嗜铬蛋白A(CGA)、突轴素(SYN)、神经细胞粘附分子(NCAM)，研究它们在NSCLC中的表达并探讨NSCLC伴NE分化的诊断。
1．材料和方法
1.1临床资料
本研究资料来源于我院1989年1月至1989年8月间接受外科切除的Ⅰ～ⅢaNSCLC病人，共计163例，全组平均年龄56岁(范围27～73岁)，男性131例(80.37％)，女性32例(19.63％)，病程0～48月，中位病程2月，右肺癌88例(53.99％)，中央型病变38例(23.31％)。按国际TNM分期，T1、T2、T3分别为11.04％、60.74％、28.22％；N0、N1、N2分别为60.74％、15.95％、23.31％；Ⅰ期76例(46.63％)，Ⅱ期18例(11.04％)，Ⅲa期69例(42.33％)。行单叶、双叶和全肺切除分别为68.71％、15.95％和15.34％。
1.2病理学分类
根据病理报告，复习原病理切片，获得原发肿瘤有代表性即癌组织较集中，坏死组织最少的福尔马林固定石蜡包埋的组织块，重新切片HE染色，根据1982年WHO肺癌组织学分类标准行病理诊断。全组鳞癌76例(46.63％)，腺癌62例(38.04％)，腺鳞癌21例(12.88％)，大细胞癌4例(2.45％)，在腺癌中腺泡性腺癌、乳头状腺癌、细支气管肺泡细胞癌、实体癌伴粘液形成分别为31例、19例、8例、4例。大部分肺癌呈中、低度分化。
1.3免疫组化(IHC)
连续切片4张，厚4μm，一张HE染色用，余供免疫组化用。采用SLAB法测定CGA、SYN、NCAM的表达。抗CGA(DAK-A3)单抗(DAKO公司)、抗SYN多抗(DAKO公司)及抗NCAM(123C3)单抗(Monesan公司)的工作浓度分别为1∶100、1∶100、1∶50，K681通用型LSAB试剂盒亦由DAKO公司提供。实验中应用微波处理抗原恢复。以已知阳性的SCLC与TC切片为阳性对照，并以切片中出现的神经为阳性内对照，已知阳性切片以PBS代替Ⅰ抗进行空白对照，实验中选择同期13例SCLC、7例TC以评价Ⅰ抗的染色效果。IHC结果通过光镜观察判别，记录染色细胞百分比与染色强度(0～3级)，因为SCLC和TC中阳性染色可见胞膜和/或胞质呈现明显特异性棕黄色颗粒，在NSCLC染色强度Ⅰ级有时很难与背景染色区分，不同人不同期的观察也会有不同的结果。因此我们参照Graziano〔1〕的标准以染色强度≥2级为标记表达阳性。
1.4统计学处理
通过χ2检验，比较三种NE标记表达的相关性与差异，及不同病理类型NE标记表达的差异。
2．结果
2.1NE标记表达的特征
全组163例NSCLC中，CGA表达为11.04％，SYN为38.65％，NCAM为24.54％，神经内分泌肿瘤SCLC与TC其NE标记表达明显高于NSCLC(见表1)。一般CGA多呈灶性染色，较少呈弥散性染色，胞浆内可见特异性染色颗粒，而NCAM与SYN多呈弥散性染色，SYN特异性染色颗粒见于细胞浆，但NCAM特异性染色颗粒既可定位于胞膜，也可定位于胞浆。在腺鳞癌，腺癌区域与鳞癌区域NE标记有同时表达，也有非同时表达，有些仅表达于鳞癌区域，而有些只表达于腺癌区域(见图1-5)。
表1NE标记表达
标记阳性(％)
NSCLC(n=163)SCLC(n=13)TC(n=7)
NCAM40(24.54)13(100.00)7(100.00)
CGA18(11.04)5(38.46)4(57.14)
SYN63(38.65)11(84.61)6(85.71)
≥1NE标记77(47.24)13(100.00)7(100.00)
≥2NE标记37(22.70)11(84.61)6(85.71)
2.23种NE标记表达的一致性
全组NSCLC有77例(47.24％)NSCLC至少有Ⅰ种NE标记表达，37例(22.70％)NSCLC至少有2种标记表达，其中30例同时有2种NE标记表达，仅7例3种NE标记均表达。从三种标记表达的关系上看，在18例CGA阳性的NSCLC中有4例SYN无表达，而在63例SYN阳性NSCLC中有49例CGA阴性，经列联表χ2检验，两者表达结果有关(χ2=13.06，P<0.005)，但存在差异(χ2=36.53，P<0.005)；在40例NCAM阳性NSCLC中有31例CGA无表达，而CGA阳性组中有9例NCAM阴性，两者表达结果有关(χ2=13.36，P<0.005)，但也存在差异(χ2=11.03，P<0.005)；同样在SYN阳性组中有35例NCAM无表达，而在NCAM阳性组中有12例SYN阴性，它们的结果有关(χ2=29.79，P<0.005)，并且存在差异(χ2=10.30，P<0.005)。说明3种NE标记表达并非完全一致，SYN的表达高于NCAM，高于CGA。从另一侧面观察推测可能CGA的特异性较好，而SYN的敏感性较好。
2.3不同病理类型NE标记表达差异
表2各种组织学类型NE标记表达
组织学类型n标记阳性(％)
NCAMCGASYN≥1NE标记≥2NE标记
鳞癌7610(13.16)8(10.53)13(17.11)21(27.63)8(10.53)
腺癌6223(37.10)8(12.90)41(66.13)44(70.97)25(40.32)
腺鳞癌217(33.33)2(9.52)8(38.10)11(52.38)4(19.05)
大细胞癌40(0.00)0(0.00)1(25.00)1(25.00)0(0.00)
合计16340(26.54)18(11.04)63(38.65)77(47.24)37(22.70)
*χ2检验P<0.05
表2为不同组织学类型NE标记表达情况，除CGA外，NCAM与SYN在不同类型NSCLC中的表达存在差异，腺癌的表达高于腺鳞癌、鳞癌、大细胞癌，三种标记的联合检测也存在类似差异。
图1肺低分化鳞癌示SYN弥散性胞浆染色IHC×50;
图2肺低分化鳞癌示CGA局灶性胞浆染色IHC×50；
图3中度分化腺泡腺癌NCAM弥散性胞浆与胞膜染色IHC×50；
图4高分化乳头状腺癌SYN弥散性胞浆染色IHC×50；
图5腺鳞癌NCAM弥散性胞膜与浆染色
3讨论
3.1NE标记的选择及其表达
尽管研究NE分化的方法很多，如电镜、IHC、生化测定NE相关的酶及分子生物学通过原位杂交检测编码NE标记的mRNA的表达，但是IHC仍然是研究NE分化广泛应用的手段〔2〕。NE标记可分为共同NE标记与细胞特异性标记。共同NE标记有胞质标记、小囊泡相关标记、分泌颗粒相关标记及胞膜标记。这些NE共同标记并非依赖于肿瘤分泌的激素而存在，往往是诊断肿瘤NE表型的第一步，特别是那些不产生和/或分泌激素的肿瘤。细胞特异性标记主要是一些多肽和生物活性胺，它们可以引起特征性的副癌综合症，另一方面也可作为丝裂原或自分泌生长因子促进肿瘤的生长与细胞的分裂。虽然存在如此众多的标记抗原，并且IHC本身技术也不断革新，但一方面抗原或因含量甚微或因以较大的前体分子出现如多肽类激素，使针对这些抗原的抗体敏感性受限，另一方面也因抗原交叉反应使抗体的特异性不够理想。Gosney〔3〕的研究显示SYN和CGA具有较高的特异性与敏感性，Addis〔2〕在其述评中补充Leu-7可能是其次的选择，但不久会被针对NCAM或其它抗原的抗体取代。正因如此，本研究选择上述三种标记CGA、SYN、NCAM运用较敏感的LSAB法研究它们在NSCLC中的表达。
嗜铬蛋白是一组分子量大小不同的的酸性可溶性蛋白，构成DCG的基质，伴随NE多肽激素出细胞。CGA仅是其中之一，由439个氨基酸组成，其编码基因位于14号染色体。有研究显示CGA的表达与DCG的出现具有一致性，本实验应用单克隆DAK-A3鼠抗，抗原来源于CGA羧基端20kDa的片段，发现11.04％的NSCLC有表达，与文献报道的217％大致相仿〔3～7〕。SYN是分子量为38KDa的结合膜糖蛋白，为神经元突触前囊泡和正常NE细胞或NE肿瘤细胞的小透明囊泡的成分。由于单克抗隆抗体在2～4小时福尔马林固定的标本中免疫反应明显降低，因此本实验选择SYN的多克隆抗体，为生物合成的人SYN的兔多抗〔3〕。其表达于38.65％的NSCLC，低于Loy〔7〕的62％，而比Schleusener〔4〕的24.3％，Carles〔8〕与Sundaresan〔5〕的23％及Graziano〔1〕的11.2％要高。NCAM属于免疫球蛋白超级家族，是一组密切相关的唾液酸糖蛋白，介导同嗜细胞粘附，在胚胎组织发育过程中起作用。其仅由一个基因编码，定位于11q23，至少有24个外显子组成，通过mRNA剪接产生不同异构体，分子大小取决于羧基端的长度。免疫斑点试验发现NCAM有3种主要异构体NCAMA、B、C，分子量大小分别为190Kda、135Kda、115Kda，NCAM-A与NCAM-B是跨膜糖蛋白，具有不同长度的细胞浆尾巴，而NCAM-C通过糖基脂酰肌醇锚着于细胞膜。NCAM分子的细胞外部分含有5个免疫球蛋白样结构域及2个纤维连接蛋白Ⅲ型同源重复片段，后者连接于胞膜干区，根据其所含α-(2，8)多聚唾液酸单位的多少，分为高唾液酸化的NCAM-H型，与低唾液酸化的NCAM-L型，高唾液酸化可形成碳水化合物屏障，减少接触介导作用，降低细胞粘附力，可能与肿瘤的侵袭行为有关〔9～10〕。NCAM在肺癌中表<