国外医学妇产科学分册1999年第26卷第6期

山东医科大学（250012）李媛盛燕综述

山东省立医院陈子江审校

摘要最近，有关人类未成熟卵母细胞体外成熟培养的研究成为生殖医学领域的又一热点。本文综述了有关卵母细胞成熟的机制、体外成熟培养的条件及影响因素等问题，并对目前已取得的成就作了简要的介绍，提出了几个有关未成熟卵的研究方向。

关键词：未成熟卵体外成熟培养

在进行体外受精-胚胎移植（ iVF-ET）治疗时，超促排卵可使妇女在同一个周期产生多个成熟和不成熟的卵子。卵子的成熟度直接关系到卵子的受精率、卵裂率及妊娠率^[1]。因此，人们进行了大量的研究，力求探索出卵子成熟的机制及其影响因素，从而能够成功地完成未成熟卵的体外成熟（ in vitro maturation,IVM）过程。有的科学家独辟蹊径，在自然周期将多囊卵巢病人的未成熟卵取出体外，进行体外成熟、受精及胚胎移植，获得了成功的妊娠^[2，3]。这样，既免除了病人的痛苦及过度刺激的危险，也节省了医疗费用，减轻了患者的负担。

在此基础上，人们考虑到在冷冻保存成熟卵子时，其第二次减数分裂中期（ metaphaseⅡ mⅡ期）的纺锤体极易受到冷冻的伤害，就用纺锤体还未形成前的第一次减数分裂中期（ metaphaseⅠ,MⅠ期）的未成熟卵进行冷冻保存研究，并已取得初步的成功^[4，5]。而且，这还为即将面临卵巢去势（手术切除，化疗放疗）的患者提供了一种保存生育力的途径；这无疑为扩大了卵子的来源，为建立“卵子库”展示了更广阔的前景。

卵子成熟的机制

在发育过程中，卵泡只会处于静止、成熟或闭锁这三种状态之一。对于决定卵泡命运的机制尚知之甚少。考虑到卵-冠-丘复合体（ oocyte-conora-cumulus complex,OCCCs）在整个成熟过程中始终浸泡在卵泡液（ follicle fluid,FF）中，所以有许多人认为 fF中的甾体和非甾体类物质的浓度与卵子的成熟有直接关系。

一、甾体激素的作用^[6]

在下丘脑-垂体-卵巢神经内分泌轴的作用下，卵泡细胞合成甾体激素，并积聚于卵泡液中。卵泡内的激素微环境是决定卵子将来发育的关键因素。通常， fF内高浓度的雌二醇（ e₂）和孕酮（ p）会促进有受精能力的卵子的生成；高浓度的雄激素（ a）和高 a/E₂比值与卵泡闭锁有关。当卵泡发生黄素化后， p成为 fF中的主要甾体激素。颗粒细胞产生的 e₂＞11100pmol/ml和 e₂/P的比值＞0.001是卵子成熟和质量优良的标志。

二、非甾体类物质的作用^[7，8]

在人类 fF中发现的一些非甾体类物质有血清蛋白、酶、颗粒细胞蛋白、氨基糖类物质和一系列多肽调节因子。这些物质的浓度随卵子的成熟会有所变化，但它们与卵子成熟的确切关系还不清楚。

卵子成熟度的鉴别

是经典，也是最常用的卵子成熟度的鉴别方法是评价 oCCCs的形态学特征。这种方法简便、快捷，不会很少造成卵子周围环境的剧烈改变，但这种方法辨别的是卵细胞的形态，而不是卵细胞核的确切情况。卵子的成熟实际上包括卵细胞浆的成熟和卵细胞核的成熟两个方面。卵细胞浆和卵细胞核在正常的卵细胞成熟分裂过程中均发挥着重要作用^[9]。 oCCCs的形态与卵细胞的成熟情况并不存在相应的关系，单纯依靠评价 oCCCs的形态会导致误判^[10]。但至今尚未发现一种可靠的生化检查能够直接检测 fF的成分，从而提供更准确的检测手段。因此，形态学观察仍是唯一至关重要的检测指标。

典型的成熟或称为排卵前卵子表现为卵丘分散，放射冠呈放射状排列，拟太阳火焰状，有第一极体，泡膜颗粒细胞丰富，排列松散。典型的不成熟卵表现为没有分散的卵丘，放射冠细胞紧密排列，紧巾在透明带外缘。细胞浆内有一个完整的生发泡（ germinal vesical,GV）。泡膜颗粒细胞小，排列紧密，呈团块状。有些卵细胞的生发泡已经消失，但尚未排出第一极体，此时卵细胞处于 mⅠ期，这是介于上述两者之间的中间成熟阶段。

未成熟卵的体外成熟

一、未成熟卵的体外培养

目前，应用于卵子体外成熟培养基中，除含15%～20%血清的基本培养液，如：人类输卵管液（ hTF）， ham氏 f10培养液或 earle氏平衡盐液等外，还包括以下几种成分：

1． fSH和 lH Borges等^[11]发现，在基本培养液中加入0.075IU/ml fSH和0.51IU/ml lH，可使60.5%的第一次分裂前期（ pI期）卵到达 mⅡ期，而不含 fSH/LH组只使49.5%的卵达到成熟。但 fSH/LH对 mⅠ期卵的效果不明显。

2． fF有的研究者在培养液中加入50%（ v/V）的卵泡液，但卵泡液是促进还是抑制卵子的成熟还存在争议^[12，13]。支持者认为 fF中含有卵子生长发育所必需的激素成分及营养物质；反对者则认为 fF中含有一种称为卵子成熟抑制因子的物质，对卵子的成熟不利。

3．颗粒细胞的联合培养^[14]用排卵前卵泡中获得的黄素化颗粒细胞与未成熟卵进行联合培养（ co-culture），可使76%的卵子获得成熟，而未用联合培养组的成熟率只有35%；而且，进行联合培养者成熟后的受精率也大大提高（54%与20%）。

4． e₂和 p将未成熟卵母细胞与颗粒细胞联合培养，发现在 fSH存在的情况下， e₂分泌增加。因此认为在进行未成熟卵的体外培养时，可以不添加 e₂^[15]。

在培养液中加或不加 p对卵子的体外成熟没有任何影响，但会使卵黄膜的不稳定性增加。已经发现，在加了 p的培养液中培养的卵子的破损率大大增加，可能是长时间用 p培养使膜发生了生化改变。

5．葡萄糖和丙酮酸葡萄糖和丙酮酸是在卵子发育成熟过程中提供能量的物质。在培养液中加入高浓度的葡萄糖或丙酮酸（1mmol/L），就会发现 gV期卵的成熟率提高，而且培养液中丙酮酸的利用率也提高^[8]。进一步研究发现，对于 gV期卵，培养的前3个小时内，主要消耗葡萄糖；而在 gV破裂后，丙酮酸的利用率却开始上升。实际上，丙酮酸和葡萄糖也是通过调节其它物质的代谢，如蛋白质和脂类的合成，或作为抗氧化剂，来影响卵子的成熟的。

6．其它 Gomez等^[16]发现：在培养液中加用表皮生长因子和胰鸟素样生长因子Ⅰ可以提高卵子的成熟率。另外， khatir等^[17]发现卵泡液中含有的22kDa和25kDa的蛋白成分在闭锁卵泡中含量较低。这些蛋白成分是否对卵子的成熟有影响目前还不清楚。

体外成熟培养的时间依据原来成熟卵的成熟程度而定。对于从自然周期取得的未成熟卵来说，一般要经过32～48h的培养，才能有80%以上的卵子获得成熟，44～54h后才能进行体外受精。

二、影响未成熟卵体外成熟的因素

1．患者年龄^[6]在各年龄组中，随年龄的增加，从每个卵巢中获取的卵子数目下降。但是，从34～39岁妇女的卵巢中取到的卵子体外成熟的成功率最高。这是因为≤33岁的妇女如果需要切除卵巢，则说明其病变较严重，所以影响到了从这样的卵巢中取到的卵子体外成熟率。另外，也不能排除卵成熟能力随年龄增长确实能够增加的可能性。

2．取卵时间^[6]在月经周期的增生期和分泌期，从每一个卵巢中取到的卵子的体外成熟率没有差别，但增生期的取卵数目较多。

3．卵子质量通过各种方法取得的未成熟卵本身的质量也直接影响到其体外成熟率及受精率。 wood等^[18]证明，质量优良、形态良好的卵的成熟率和受精率均高于质量欠佳的卵子。

4．卵子来源 Barnes等^[19]发现，取自月经周期不规律的多囊巢病人的未成熟卵的成熟、受精及卵裂能力均大大低于取自月经周期规律者。这可能与多囊卵巢病人的卵泡中雄激素水平较高有关，也可能只与卵子大小有关，因为较小卵子的生长发育能力不如较大卵子。

未成熟卵培养的临床应用

一、从刺激周期的卵巢中得到的未成熟卵

已经有许多生殖医学中心报道了从刺激周期的卵巢中得到未成熟卵后，经体外成熟、受精及胚胎移植，获得了妊娠成功^[1，6]。

二、从未刺激的卵巢中得到的未成熟卵

1991年 cha等^[2]首次报道了从未刺激周期的卵巢中取到未成熟卵并获得妊娠。该例患者为一卵巢早衰妇女。从供者的未经促性腺激素刺激的卵巢中得未成熟卵进行体外成熟及受精后，得以移植5个胚胎，出生了3个健康的婴儿。此后，至1992年，用该方法他们又获得了另外6例妊娠。

三、从 pCO患者的卵巢中取到的未成熟卵

trouson等^[3]（1994）报道了从 pCO患者的卵巢中取得未成熟卵进行体外成熟培养取得得成功妊娠的经验。 cha等^[2]也进行了该方面的研究。从27个未刺激的不排卵 pCO病人中共取到未成熟卵258个。经48小时的体外成<