CHINEXE JOURNAL OF OBSTETRICS AND GYNECOLOGY

1999年第34卷第6期vol.34No.61999

周郅隆

关键词：母血 胎儿细胞 产前诊断

绒毛活检和羊水细胞核型分析，是目前主要的产前诊断方法，因其为侵入性的检测技术，对母儿存在着一定程度的损伤及并发症。为此，近年来许多学者应用超声检测、母血标记物和从脐血中抽取胎儿细胞来提高产前诊断的正确性和扩大其应用范围，但仍受到技术操作和诊断困难的限制。分子生物学的发展，使人们可以从母血中分离出胎儿细胞，并进行核型分析和基因诊断。该方法为非侵入性，对母儿无任何损伤或并发症，且有一定的确诊率，现简述如下。

一、胎儿细胞富集发展史

1996年Walknowska等^［1］首先在妊娠男性胎儿的孕妇血中分离出胎儿细胞，并找到“XY”有丝分裂中期细胞。1971年De Grouchy等^［2］同样也找到“XY”有丝分裂中期细胞。 Herzenberg等^［3］在1979～1981年间连续数次应用流量拣选法（flow-sorting techniques）富集到人白细胞A抗原(HLA-A₂)淋巴细胞，该抗原在母系中不存在，而只存在于父系中。因而，HLA-A₂淋巴细胞来自胎儿。伴随着聚合酶链反应(PCR)技术的问世，又提出了应用PCR来证实母血中存在胎儿细胞的方法。1989年Lo等^［4，5］成功地放大了1个Y-序贯，证明妊娠男性胎儿的孕妇通过上述检测，显示杂交后的Y-特异性信号的可能绝对超过妊娠女性胎儿孕妇。

二、富集的胎儿细胞种类

1.滋养细胞（trophoblasts）：滋养细胞与子宫的关系最紧密。当他们侵入子宫内膜时，很可能有若干滋养细胞进入母血循环。Covone等^［6］应用抗H315单克隆抗体，在不同孕期中均能从母亲末梢循环中分离出滋养细胞。接着，许多学者又从胎盘中分离出了6 000种抗滋养细胞单克隆抗体，用于从母血中分离胎儿细胞。Mueller等^［7］认为，其中有5种对胎儿细胞有特异性，他们作了PCR扩增证实有Y-序贯存在。Bruch等^［8］应用代号为GB17、GB21、GB25的单克隆抗体对合体滋养细胞进行分离。另外，应用GB25单克隆抗体同时对合体滋养细胞和细胞滋养细胞进行分离,发现并无特异性。Cacheux等^［9］应用免疫磁性淋巴细胞去除法和流量拣选法分离出胎儿细胞，并进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH），检出47XYY细胞，在1 387个细胞核中，只有14个（1％）显示2个Y-特异性区域（domain），而45个（3.24%）则显示1个Y-特异性区域。

2. 淋巴细胞(lymphocyte)：Herzenberg等^［3］应用Ficoll-Hypaque密度位差离心法，从母血中分离出胎儿白细胞，通过荧光激活细胞拣选法（fluorescence-activated cell sorting， FACS）检测分离出的白细胞是否为HLA-A₂阳性，因为父系是HLA-A₂阳性，而母系则为阴性，再行染色，找寻Y-染色质。Simpson等^［10］从男性胎儿或非整倍体胎儿的母系中分离出的中期细胞都是46XX，说明存在着的是胎儿淋巴细胞，且对裂变物无反应。因前次妊娠留下的淋巴细胞可持续存在于母体中^［11］此法现已摒弃不用。

3. 颗粒白细胞（granulocytes）：Wess- man等^［12］应用Ficoll-Paque密度位差离心法，分离出胎儿细胞，再用FISH及Y-特异探针，找出多种染色质（heteroc- hromatic）的Yq，但未进行胎儿细胞富集即获得如此多量的胎儿颗粒白细胞，无法给以圆满解说，因而不可靠。

4. 有核红细胞（nucleated red blood cell，NRBC)：孕11周时，在胎儿循环中NRBC占红细胞总数的10％^［10］，孕19周时为0.5％，成人中NRBC极为罕见。因而，母体中如发现NRBC必来自胎儿。在脐血及新生儿血液中，NRBC为分裂最快的细胞，且胎儿红细胞可存活90天，远比成人红细胞只存活30天为长^［13］，因而，可以选择NRBC作为分离的胎儿细胞。

Bianchi等^［14］首先应用转铁蛋白受体(transferrin receptor，CD71）阳性的流量拣选法，分离出胎儿NRBC，以PCR显示出Y-序贯的8例中，6例为妊娠男性胎儿的孕妇血标本。血型糖蛋白A(GPA)为造血红细胞膜中主要涎腺糖蛋白，它存在于红细胞系，不存在于白细胞系。故如与CD71和GPA抗体均结合者，很可能是早期的红细胞，即胎儿红细胞。

Durrant等^［15］应用对细胞滋养细胞和合体滋养细胞均能认识其表面抗原的抗体340，在早孕期母血中分离出滋养细胞，同时加用3倍密度位差分层离心法（triple gradient），表面涂有CD71的磁珠继以Mini磁激活细胞拣选柱（mini magnetically activated cell sorting），可分离出胎儿NRBC，男性胎儿诊断正确率可提高至83％，女性胎儿则为100％。因而，近年来许多学者都采用分离胎儿NRBC来进行产前诊断。

三、分子生物学胎儿细胞富集技术

在母亲末梢血中，胎儿NRBC为数甚微，与母亲有核红细胞之比为1∶1×10⁷～1∶1×10^8［10］，也有报道为1∶4.75×10⁶～1∶6×10^7［16］。因此，要取得足量胎儿NRBC进行产前诊断分析，是一项艰难的工作。

1. 流量细胞仪（flow cytometry）：流量细胞仪一直被应用于富集胎儿细胞，目前，以方法改良为多参数测定法^［17］，包括血小板大小，细胞颗粒程度，抗CD71阳性，以及抗GPA阳性等4项参数，对富集的胎儿细胞进行二次PCR扩增，然后再以原位杂交及特异性探针检测。Price等^［17］通过多参数流量细胞仪测定了18个样本的胎儿NRBC，进行PCR扩增，单拷贝Y-特异DNA序列，12例男性胎儿100％确诊，6例女性胎儿5例确诊，总确诊率为94％（17/18）。Adkison等^［18］对50例孕11～16周的母血中胎儿细胞，以寡核苷酸原始质（oligonucleotide primer）——YCH₁及YCH₂，检认其248bp的Y染色体特异片段，在30个周期的扩增后，确认了19例男婴，在第2次30个周期扩增后，又确认了3例男婴，从常规染色体核型分析中得出24例为男婴，故1次PCR扩增确认成功率为79.2％（19/24），而第1次加第2次为91.7％（22/24），无假阳性。

2. 荧光激活细胞拣选法（fluores- cence-activated cell sorting， FACS）和磁激活细胞拣选法（magnetically-activated cell sorting， MACS）：母血中胎儿细胞数目少，PCR可扩增细胞数，但易被母血细胞污染，从而导致假阳性结果。Vaccaro等^［19］提出，在胎儿细胞表面涂以荧光免疫染色的抗原——荧光FACS，应用对其高度特异性的单克隆抗体，富集胎儿细胞，这样，可避免应用PCR而发生母细胞污染的可能性。

磁激活细胞拣选法^［19］是近年来发展起来的一种拣选细胞的方法。磁分离系统包括：(1)磁化颗粒或磁化珠，(2)提供磁力的磁铁。磁化颗粒或磁化珠又分两类：非磁化物如：乳胶、纤维素或白蛋白，内封嵌有少量磁性物质（氧化铁）；磁性物质主要为氧化铁。

磁激活细胞拣选法有两种拣选胎儿细胞的方法。(1)负拣选法（negative selection）。分离出污染的或需去除的细胞，而留下所需要的纯化细胞。(2)正拣选法（positive selection）。分离出需要的靶细胞，也可以多次拣选，最终得到较纯化或高度纯化的胎儿细胞。

Vaccaro等^［19］较系统地介绍了磁激活细胞拣选法的操作步骤和提高成功率的关键因素。Ganshirt等^{［20，21］}报道应用胎儿NRBC表面可见到转铁蛋白受体抗原表达这一发现，将胎儿NRBC以抗转铁蛋白受体单克隆抗体或与GPA共同标记，然后以FACS或磁激活细胞拣选法进行富集，与3倍密度位差分层离心法（triple density gradient）合用^［22］，成功地在母血中捡出10例21，三体综合征和5例18，三体综合征。此法是快速、廉价、高效的富集胎儿NRBC及检测三体综合征的最先进的方法。Pezzolo等^{［23，24］}成功地应用上述综合法，分离出胎儿NRBC及作出三体综合征的产前诊断。

Zheng等^［25］对上述综合法又进行了改良，他们应用老鼠抗CD45和CD32的特异性抗体，去除母血中的白细胞。此外，磁激活细胞拣选法往往易引起感染，因为未消毒的磁珠会影响FISH。为了克服此缺点，他们又加用了老鼠的抗胎儿血红蛋白抗体UCHγ，与FISH同时进行免疫表型化（immunophenotyping），应用X及Y特异性DNA探针，可以更进一步提高诊断正确率。

3.单克隆抗体的选择：目前，较广泛应用于胎儿细胞分离者有：(1) 单克隆抗体340^［15］，它可辨认在合体滋养细胞和细胞滋养细胞上的表面抗原，它与磁珠相连，并应用3倍密度位差离心法及Mini磁激活细胞拣选法，可同时富集滋养细胞和NRBC，男性胎儿的辨认正确率为83％，女性胎儿为100％。(2) 抗转铁蛋白抗体CD71和抗GPA抗体^［21］是在磁激活细胞拣选法中最常用的单克隆抗体，它们随孕周而增高，在胎儿NRBC上高度表达，最适宜于分离胎儿细胞之用。磁激活细胞拣选法的磁珠小，能很好维持NRBC原来形态，便于作FISH。杂交后，三体综合征的3个信号出现率为9%～17％，而正常对照组为0%～7％。(3) 除了CD71、GPA以外，Zheng等^［26］还研究了2-6B/6、FB3-2、H3-3、CD36等，他们也随孕周