国家重点实验室斑马鱼破译人类基因

随着人类基因组测序工作及精细图绘制的完成，大量新基因序列随之产生，同时也宣告功能基因组时代的到来。面对如此众多的新基因，如何理解这些基因的功能是摆在各国科学家面前的一项艰巨任务。好在科学家手中拥有一个强有力的解析基因功能的工具——模式生物，他们可以通过寻找与人类某个未知功能基因相当的模式生物体内的基因（即所谓直向同源物），并对其功能进行研究，从而加深对人类该基因功能的认识。通过对模式生物体表型变化（突变体）的分析，可在动物整体、细胞或分子水平认识基因的功能。国际上现已有科学家在从事通过线虫、果蝇等模式生物体大规模筛选重要功能基因的工作。但线虫和果蝇与人相距甚远，包括造血功能在内的许多人体重要生理功能以及相关的疾病基因，在这些模式生物体内并不存在。而小鼠是公认最好的模式生物体之一，但其繁殖速度较慢，且体积相对较大，表型出现的时间也相对较长，因此限制了其作为大规模高通量新基因功能研究的模式生物体的应用。就在这时，斑马鱼——这个体长不足3厘米的小东西，跃入了科学家模式生物研究的视线。

上海瑞金医院医学基因组学国家重点实验室的宋怀东博士今年只有30多岁，却已经与斑马鱼打上了交道。他介绍说，斑马鱼是一种生长在印度的硬骨鱼类，容易饲养，3个月即可达到生殖成熟期，每一个成年母鱼每星期可产卵200个。更为独特的是，斑马鱼的胚胎发育是在体外完成，而且是透明的，这不仅使人们很容易得到胚胎，而且还可以在显微镜下直接观察斑马鱼胚胎发育的过程，不仅可作为脊椎动物模型来研究脊椎动物的胚胎发育，还是一种可用于人类疾病研究的非常重要的模式生物体。

宋怀东告诉记者，人们可以通过对斑马鱼的突变体进行遗传疾病模型的研究，不仅能够明确一些已知基因的功能，而且还可以发现一些新的基因并提供这些基因的功能。科学家常用的产生斑马鱼突变的方法有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或X射线照射、插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%～0.2%，累及的是单个基因的突变。射线照射则会导致染色体大片段的缺失或染色体的重排，产生的突变率高达1%，但由于其突变常累及多个基因，突变的表型通常是若干个基因功能改变的共同结果，因此不利于进行致突变基因的功能分析。而插入诱变以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼的受精卵中，整合到基因组中，干扰正常基因的表达，但其产生的突变的效率较低，仅为ENU化学诱导法的1/10。因此，ENU化学诱导法是目前诱导斑马鱼突变的最主要方法。

目前已经有许多大规模的突变筛选计划在斑马鱼中进行，几千种不同的影响斑马鱼各种组织发育的突变体被筛选出来。因为斑马鱼独有的特征——透明的胚胎在体外发育，使人们很容易观察胚胎是否有红细胞或血红蛋白的生成，因而特别适宜于造血疾病的模型筛选，并对造血系统的病理和生理功能进行研究。正是应用斑马鱼的这一特性，宋怀东在哈佛大学医学院的合作者Leonard I Zon教授领导的研究组已经筛选出50种影响红系造血的突变体鱼。这些不同类型的突变导致的表型改变涉及斑马鱼造血的不同时期，根据表型不同可以分为5类：不能造血、造血前体细胞增殖受阻、造血前体细胞分化受阻、着色不足和光敏感性血液病。

在这些特定的表型中，有许多类似于人类的某些先天性贫血或地中海贫血，因此这些模型可作为研究造血干细胞的分化及血红素合成缺陷导致先天性疾病的动物模型。比如，采用定位克隆策略，有学者发现了斑马鱼的一种突变类型sau的致病基因——这种突变的斑马鱼出现小细胞低色素性贫血，并伴有胚胎期明显的血色素减少，在外周血中出现不成熟的红细胞。研究证实，这种表型的出现是由于红细胞内血红素合成的关键酶ALAS-2基因突变所致，而在人类ALAS-2基因突变则可引起X连锁的先天性铁粒幼红细胞性贫血，而且其特征性临床表现与sau突变体斑马鱼的某些变化相似，这也是人类该疾病的第一个动物模型。除此之外，科学家还利用斑马鱼发现了在人类和小鼠中也同样存在的一个编码铁转运蛋白的新基因，该基因突变后会使肠道内铁的吸收转运障碍，引起低色素性贫血；而其同源基因在人类发生突变则会导致常染色体显性遗传的血色素沉着病。另外，斑马鱼的地中海贫血模型也已建立，并被证实与血红蛋白的一个基因座有关。这些突变体对深入研究铁代谢、血红素代谢及血红蛋白的调节和合成等都提供了重要模型。

尽管随着不同表型的斑马鱼致病基因定位克隆的完成，无疑会加快人们对许多重要基因功能的理解，但基因的定位克隆工作却十分烦琐，科学家的工作量仍非常巨大。“好在随着斑马鱼基因组测序工作的即将完成，大量斑马鱼的基因将被识别，从而可能使ENU的突变筛选发生根本的改变。”宋怀东欣喜地表示。他介绍说，目前的筛选工作是首先筛选表型，然后对引起表型的基因进行基因克隆，进而研究该基因的功能。而斑马鱼大量基因序列获得后，人们就可以首先筛选特定基因的突变，然后观察基因突变后对表型的影响。特别是法国Thisse教授利用斑马鱼胚胎透明的特点建立的斑马鱼全胚胎原位杂交技术，使得人们大规模、高通量迅速筛选斑马鱼胚胎期组织特异性表达基因成为可能。

宋怀东告诉记者，他们通过与Zon教授合作，已经开展了成年斑马鱼造血组织肾脏的大规模基因表达谱的研究，得到了8100多个基因品种，并进一步利用全胚胎杂交技术筛选出了100多个有相对特异组织表达谱的基因。同时将与Thisse教授合作，进行斑马鱼造血干细胞比较基因组学的研究，预计能够获得5000个基因品种。宋怀东希望，能够通过与国际上多家优势实验室的合作，利用斑马鱼全胚胎原位杂交技术和DNA芯片技术，力争在2～3年内完成1万个人类基因的斑马鱼直向同源物的基因表达谱研究，发现1000～2000个斑马鱼不同组织特异表达的基因，然后对斑马鱼造血组织部分特异表达的基因，采取阻断特异基因的表达或在基因组上造成定点突变等方法，分析基因突变对斑马鱼的影响，进而加深人们对斑马鱼造血过程的理解，为开发治疗某些血液疾病的药物提供可能的分子靶点。

人们越来越意识到，模式生物体是全面准确解释基因功能的有效手段，将被更为广泛地应用于未知基因的功能和人类疾病的研究。随着基因组技术的完善，加上斑马鱼众多有利于基因组功能研究的特点，以斑马鱼为模式生物体的研究，将在未知基因的功能和人类疾病机制的研究中，有着诱人的应用前景。

2004.03.25

科学时报