陈大元细说克隆牛

据《科学时报》(马晓岚)：家畜体细胞无性繁殖研究是国家自然科学基金委重点资助项目，其中有关克隆羊的两个研究已于1999年和2000年先后完成。有关克隆牛的工作于近日完成并通过鉴定。从体细胞培养、重构胚的构建，到重构胚的体外培养和胚胎移植，相关技术均是在国内自主完成的。它的成功实现了我国成年体细胞克隆牛成活群体零的突破，使我国成为继日本(1998年)、新西兰(1998年)、美国(2000年)等国家之后，掌握体细胞克隆牛关键技术的少数国家和地区之一；缩小了与世界先进水平之间的差距，为产业化远期目标积累了第一手资料，其中，重构胚的囊胚发育率、妊娠率、产犊率和克隆率，综合达到国际同类研究先进水平。

为使读者详细了解克隆牛工作在我国的最新进展及相关背景，日前，《科学时报》记者专访了该项目首席科学家，中国科学院动物研究所陈大元研究员。

记者：您从2001年3月开始率领你的克隆动物研究小组与山东中大动物胚胎工程中心合作，于近日成功克隆了第一批牛犊。目前对克隆牛的鉴定结果如何？

陈大元：鉴定会于2002年2月26日-27日进行。与会的9位专家认为这是国内首次利用成年母牛和公牛的成纤维细胞作为核供体细胞成功进行的规模较大的克隆牛研究，研究中采用来自成年高产奶牛和盖普威种公牛体细胞作为供核细胞，移入去核的鲁西黄牛卵母细胞后，分别有29.55%和23.98%的重构卵发育至囊胚。将230枚(其余31枚冻存)形态良好的囊胚通过非手术法移植给112头受体牛，有26头妊娠，妊娠率为23.2%，14头受体牛在怀孕过程中流产，怀孕到期的12头受体牛中1头怀有来源于盖普威18号种公牛体细胞的克隆胚胎，11头怀有来源于603号高产奶牛体细胞的克隆胚胎，9头克隆牛在出生后死亡，5头存活至今的均为奶牛，经微卫星分析证明，所有克隆牛的基因型都与体细胞一致，而与代孕母牛无关。会后为了确保结果的准确性，又到上海基康生物技术有限公司进行第二次DNA鉴定，证明结果准确无误。

记者：克隆牛犊是否是完全意义上的“MADE IN CHINA”？

陈大元：国内前两次生产的克隆牛，如在深圳诞生但后来喂奶时被呛死的克隆牛，是由中国农大研究组在新西兰实验室由卵丘细胞构建的胚胎，拿到国内移植后诞生的；莱阳农学院的两只克隆牛则是由该校在日本留学的博士在日本以胎儿皮肤上皮细胞为供核细胞构建的胚胎在国内移植后诞生的。这次从构建克隆胚胎到克隆胚胎移植都是在山东省曹县做的，我们研究小组负责构建克隆胚，山东中大动物胚胎工程中心的专家负责移植，因此应该称其为我国“土生土长”的克隆牛。

记者：中国克隆技术是从什么时候开始的？

陈大元：动物克隆是1938年，德国发育生物学家Speman为了解决核质相互关系问题，提出了核移植这一设想，但由于技术条件的限制，未能得以实施。直到20世纪50年代才有两栖类美洲豹蛙和非洲瓜蟾克隆实验见于报道。早在60年代，我的老师童第周院士就用囊胚细胞进行鱼类核移植，70年代获得属间和种间核移植鱼。那时叫细胞核移植，实际上就是现在叫的克隆技术。1981年Illmensee和Hoppe用小鼠胚胎细胞作为核供体进行了核移植并产出个体，这是哺乳动物中首次克隆的报道。不幸的是他们的实验没能被McGrath和Solter等人重复出来。1997年我的学生在美国克隆过猴，当时都是胚胎细胞克隆。到1997年英国率先利用成年体细胞成功地克隆出第一只绵羊“多利”，一时成为全球的热点。那么，我们的体细胞克隆为什么会落后？应该是受传统理论的影响，我们搞的比较晚；1995年我们才想到用体细胞克隆，在申请“863”项目时提出研究“精原细胞核跨越发育”，就是设想向体细胞的研究发展。精原细胞与体细胞一样，是两倍体的细胞，但精原细胞是生殖细胞，我想比体细胞可能容易些。可是没想到两年后，国外用体细胞已经克隆了“多利”羊。所以，我们马上把方向转向体细胞克隆研究，1998年我们承担了由国家自然科学基金委重点资助的克隆牛项目。

记者：较胚胎克隆而言，体细胞克隆有何特殊意义呢？

陈大元：胚胎细胞是一个没有分化的细胞，如受精卵变成两细胞、四细胞、八细胞等，甚至到囊胚里边的内细胞团细胞。到原肠胚以后，他们将分成三胚层，分成外胚层、中胚层、内胚层，外胚层就演化成为皮肤等；内胚层就演化成为消化道上皮等；中胚层演化成骨骼、肌肉和结缔组织；这些组织的细胞为分化的细胞。胚胎细胞是没有分化的，克隆比较容易。

体细胞是高度分化的，可是现在就用这样的体细胞来克隆照样也能够恢复全能性，恢复到胚胎细胞具有的功能。就是在卵子里面有一些去分化因子，能够使进去的高度分化的体细胞核去分化、重新程序化变成一个与胚胎细胞一样的全能性的细胞。所以它能继续发育分化成两细胞、四细胞和八细胞。与正常的胚胎发育一样，发育成囊胚，然后移殖到受体子宫里去。所以体细胞克隆的意义就在于它是生物学的基础理论上的一场革命，因为高度分化的细胞的很多基因是关闭的。现在放到卵子里能够获得全能性，也就是说基因被重新打开了。从方法学上讲，英国克隆的“多利羊”是一场革命。大框架与我们过去做的胚胎细胞克隆基本是一样的，当然一些细节是有区别的。实际上，我们国内的克隆技术的基础是很好的。

记者：国产克隆牛出世何以晚三年？

陈大元：在国际上克隆技术的一些理论问题到现在还处在研究当中，例如，去分化因子究竟是什么？国际上还没有一位科学家把这个因子提取出来，叫什么还不知道。这些基本问题都需要进一步的探索。体细胞核和卵子之间的关系奇特，从外面来的细胞放到它的里面就能分裂成两细胞、四细胞、八细胞，但究竟为什么？不知道。此外在克隆过程中为什么克隆牛会比一般的牛大，以致于出生困难(国外一般是采取剖腹产的，而我们这次的克隆牛大部分是自然分娩)。也有人说克隆牛的消化系统和呼吸系统有问题，到底是什么原因？毕竟从国际上第一次用体细胞克隆到现在仅仅五年时间。所以寻找愿意与我们合作的企业就难一些。对企业来说这是风险性投资，我们国家与国外相比抗风险的能力毕竟小(所以在选择合作对象过程中耽误了一些时间)。过去我们先后在天津和安徽两地开展了两次克隆胚胎移植，但因种种原因未获得成功。

记者：克隆技术的产品是否对人健康有影响？

陈大元：克隆技术和转基因动物不一样，基因对人究竟是好是坏目前争论很多。克隆牛就不一样了，因为牛在正常繁殖时是用精子与卵子，而我们克隆是用它身上的体细胞代替，不带任何外源基因、激素和药。所以这样构建的动物产品对人体是无害的、安全的。

记者：如何克服现在克隆中存在的问题，早日实现产业化？

陈大元：任何一种技术，只有转化为生产力，才能体现出其价值，我们现在想得最多的，就是如何让克隆牛从实验室里出来。克隆技术马上产业化还存在许多问题。如现在的克隆胚胎技术还存在受胎率低、流产率高的问题。这批克隆牛的怀孕成功率只有20%左右，而常规胚胎移植可达50%以上；流产率为50%以上，正常的流产率是10%-15%。由于胎膜破裂、干尸、胃出血、肺炎、肠扭转、机械性损伤以及妊娠期受体牛患病用药打针影响胎儿发育等死亡九头，这说明成活率低。但单批克隆这么多牛，在世界上还是算多的。由此可见，这是一项“实践带着理论跑”的工作。要在餐桌上吃到我们的克隆牛的牛奶是我们长远的目标，实现产业化要做更多的研究。

我们希望能建造一个国内最大的基地或者中心，把克隆技术作为一个“旗帜”，搭建一个技术含量高的平台，吸引国内外所有愿意共同合作的学术小组和企业，发挥各自的特长。因为单独用克隆技术来推动产业化还有一个相当长的时间，克隆技术与现有成熟的生物技术结合起来，才能使这个产业化的时间变短，比较快地推动产业化进程。

如果条件允许的话，估计在今后的5-10年里，保持大批高产育种奶牛群体制造高产奶牛胚胎的同时，通过有性胚胎构建和胚胎移植，实施试管牛技术，生产大量的高产生产牛群；通过无性繁殖的克隆技术复制特优奶牛，进行奶牛产业化。

陈大元： 1957年毕业于山东大学生物系胚胎学专业，师从童第周教授和张致一教授，现为中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室研究员、博士生导师和受精生物学学科带头人。1984年从美国IOWA大学医学院回国后，长期从事受精机制研究，并开展显微受精和动物克隆研究。现为国家科技部“克隆大熊猫研究”攀登专项的首席科学家、国家自然科学基金委员会“家畜体细胞无性繁殖研究”的首席科学家、中国科学院“异种克隆大熊猫研究”创新工程重大项目的课题主持人。

摘自：《中国科学院网》

2002.03.12