【摘要】 目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBBCTAB融合蛋白， 用SDSPAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1 158 bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pETctxAB，SDSPAGE及Western blot分析显示重组质粒pETctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。

【关键词】 霍乱弧菌；重叠PCR；融合基因ctxAB；克隆；基因表达

Cloning of the Fusion ctxAB of Vibrio Cholerae and Its Induced Expression in E.coli

ZHANG Lei，ZHANG Li，CHEN Jianping， WANG Tao，LIU Desong，TIAN Yu

Abstract: Objective To construct the fused expression vector of ctxA gene and ctxB gene of Vibrio cholerae and to realize the expression of ctxAB gene of Vibrio cholerae in E.coli and to lay basis for future research on the values of immunogenicity and immunoadjuvant. Method In this study, the fusion gene ctxAB containing ctxA and ctxB gene was obtained from DNA of Vibrio cholera by overlap PCR, and to construct recombinant plasmid pETctxAB the fusion gene ctxAB was cloned into prokaryotic expressed vector pET32a(+) containing thioredoxin gene Trx, and pETctxAB was transformed into E.coli strain BL21(DE3). pETctxAB was analyzed with restrictionendonuclease digestion, PCR and DNA sequencing analysis, and was induced with isopropyβDthiogalactoside (IPTG) to express fusion protein TrxCTAB, and TrxCTAB was examined with SDSPAGE and Western blot techniques. Result Restriction endonuclease digestion, PCR and DNA sequencing analysis showed that the ctxAB gene of 1 158 bp was amplified from Vibrio cholerae DNA, and the recombinant plasmid pETctxAB was constructed and detected its expression in prokaryotic cell successfully with SDSPAGE and Western blot techniques. Conculsion The ctxA and ctxB gene of Vibrio cholerae were fused together by overlap PCR, and the fusion ctxAB gene has highly expressed in E.coli.

Key words:vibrio cholerae;overlap PCR;fusion gene ctxAB;clone;gene expression

Address reprint requests to:CHEN JianpingSchool of Basic and Forensic Medicine, West China Medical Center, Sichuan University, Chengdu Sichuan 610041,China

霍乱是世界七大流行病之一，为我国甲类法定传染病，它是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病。霍乱毒素（cholera toxin，CT）是引起霍乱的主要致病因子，具有很强的免疫原性和佐剂活性，由一个A亚单位（cholera toxin subunit, A，CTA）和5个B亚单位（CTB）组成。CTA是毒素的活性中心，在其发挥作用前需经蛋白酶作用裂解为A1和A2两条多肽，其中A1具有ADP－核糖基转移酶活性，CTB能与肠粘膜上皮细胞的神经节苷脂GM1特异性结合， CT的免疫原性和佐剂活性与CTA、CTB均有关系。国内外对CTB和CTA的研究颇多，但尚无人对CTA和CTB融合蛋白的免疫原性和佐剂活性进行过研究。在本研究中首次将ctxA和ctxB基因利用重叠PCR融合在一起，并将融合基因ctxAB克隆到原核表达载体pET32a(+)中，以构建原核表达重组载体pETctxAB，使其在大肠杆菌BL21中得到了表达，为其作为佐剂的应用研究奠定基础。在本研究中ctxA和ctxB基因的融合采用了重叠PCR技术，即通过两轮PCR，无需连接酶的参与，直接通过PCR将ctxA和ctxB基因融合为ctxAB基因。而常规双基因或多基因的连接多采用平端或粘端在连接酶的作用下进行连接，连接需要分步进行，费时、费力、且连接效率较低。本研究中采用的重叠PCR则具有简便、快速、连接效率高等优点。

方法

菌株与质粒 霍乱弧菌古典型569B标准株及其免疫血清由中国疾病预防控制中心传染病控制所惠赠。BL21 (DE3)、质粒pET32a(+)由本室保存。 酶及主要试剂Takara ExTaq酶购自天泰试剂公司，NEB T4DNA连接酶购自基因试剂公司，Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体及其它试剂购自天泰生命科技有限公司。细菌培养 取新鲜BL21(DE3)菌株接种于预先预热至37 ℃的LB培养基，37 ℃剧烈振摇培养2 h，CaCl2法制备感受态细胞［1］。DH5α接种于LB培养液，37 ℃，12～16 h，收集菌液，用小量碱裂解法提取质粒pET32a(+)。重叠PCR扩增融合ctxAB 基因的扩增1)以霍乱弧菌DNA为模板，根据文献报道的霍乱毒素基因（ctx）序列，自行设计合成扩增霍乱弧菌ctxA和ctxB基因的引物。ctxA基因上游引物（P1） 为：5′CGCGGTACC CATTATATGGTAAAGAT3′，在5′端加入Kpn Ⅰ限制性核酸内切酶位点，下游引物（P2）为：5′TTTAATCATGAATTCATCCTTAATTCT3′，其中在ctxA基因的终止密码TTA中插入一个C（即在相应的P2引物T∨AA中插入一个G），使之突变为TTCA（即在P2引物相应的位置处为TGAA），从而通过产生的移码突变，去除突变位点后的ctxA的终止密码TGA，并保证ctxB起始密码ATG的正确通读（图1）。ctxB基因上游引物(P3) 为：5′GATGAATTCATGATTAAATTAAAATTT3′带有与P2互补的18 bp的序列，下游引物（P4）为：5′CCCAAGCTTTATCTTAAT TTGCCATA 3′， 在5′端加入Hind Ⅲ酶切位点。 PCR反应Ⅰ：以霍乱弧菌569B DNA为模板，用P1、P2扩增ctxA基因，扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。 PCR反应Ⅱ：以霍乱弧菌569B DNA为模板，用P3、P4扩增ctxB基因，扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。2)重叠PCR扩增融合ctxAB基因: 利用重叠PCR技术［2］，通过两轮PCR扩增出融合的ctxAB。方法：以纯化后的PCR反应Ⅰ产物（ctxA）和PCR反应Ⅱ产物（ctxB）为模板，以ctxA、ctxB的18 bp的互补粘性末端为引物，扩增出少量融合的ctxAB，扩增条件：94℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，10个循环，进行第一轮PCR反应，然后在第一轮PCR反应体系中再加入引物P1、P4，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，20个循环；最后72 ℃延伸5 min，大量扩增融合的ctxAB。而如果用传统的方法则需要通过PCR先分别扩增ctxA和ctxB，再分别纯化ctxA和ctxB，纯化后的ctxA和ctxB还需经过酶切、再纯化，最后用连接酶来连接ctxA和ctxB以形成融合的ctxAB。相比较而言，在本研究中所采用的重叠PCR则较为方便、快速，只需经过两轮PCR，即可直接通过PCR即将ctxA和ctxB基因融合为ctxAB基因（图1）。

ctxAB基因的克隆 用Kpn Ⅰ 和Hind Ⅲ 双酶切重叠PCR扩增出的ctxAB融合基因，同时用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切载体pET32a(+)，纯化双酶切的产物，并将纯化后的ctxAB融合基因及载体pET32a(+)按摩尔比2∶1加入连接反应体系，T4DNA连接酶连接，转化预先制备的感受态大肠杆菌BL21（DE3），涂布于含氨苄青霉素的SOB平板上（平板内含Xgal和IPTG），37℃培养过夜。挑取白色菌落、提取质粒进一步用PCR鉴定、筛选阳性克隆。将构建的重组质粒命名为pETctxAB。阳性重组质粒的鉴定 1)重组质粒的PCR鉴定:以重组质粒DNA为模板，用引物P1和P4进行PCR扩增，扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。2)重组质粒的酶切鉴定：用限制性核酸内切酶Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ分别对重组质粒DNA进行单酶切和双酶切，酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。基因序列测定 将经过酶切及PCR鉴定正确的重组质粒pETctxAB送交Invitrogen公司进行测序鉴定。ctxAB的诱导表达及检测 挑选带有pETctxAB质粒的BL21（DE3）菌种接种于5 ml含有氨苄青霉素的LB培养液，37 ℃振荡培养2 h，至OD600≈0.5~0.8，加入IPTG（终浓度为1 mmol/L），37 ℃继续振荡培养5 h，10 000 r/min，30 s离心收集菌体。用1 ml PBS洗涤菌体1次，加入PBS 300 μl悬浮细菌，再加入5 μl 10 μg/ml 溶菌酶, 轻轻摇匀，室温放置30 min，然后-70 ℃冰箱至37 ℃反复冻融10次。12 000 r/min，5 min，收集上清和沉淀，将上清与2×SDS上样缓冲液等量混匀，沉淀加入100 μl 1×SDS上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，取15 μl 按Laemmli法进行SDSPAGE电泳分析，然后电转印到硝酸纤维膜上，进行Westernblot鉴定，霍乱弧菌兔血清抗体浓度为1∶1 000，酶标第二抗体工作浓度为1∶5 000。

图1 重叠PCR扩增融合ctxAB基因（略）

Fig.1 The amplification of fusion ctxAB with overlap PCR

结果

重组质粒pETctxAB的PCR鉴定 采用引物P1和P4对所构建的重组质粒pETctxAB进行PCR扩增，得到一条约1 158 bp的预期的DNA片段，与本实验设计相符（图2）。

重组